Un método in vitro para detectar esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha afección,

que comprende:

a) cuantificar el nivel de fosforilación de la proteína Sp1 en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto; y

b) comparar dicho nivel con el de una muestra control;

en donde un aumento en dicho nivel relativo al del control es indicativo de EHNA

Sp1 fosforilado como marcador en el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y diana en el cribado de fármacos para EHNA.

Campo de la invención

La invención se refiere, en general, al diagnóstico in vitro de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA); más específicamente al diagnóstico temprano de EHNA o para confirmar la enfermedad basado en una sobreexpresión del factor de transcripción Sp1 fosforilado en células hepáticas. La invención también se refiere al seguimiento del efecto de la terapia administrada a un individuo con EHNA. Además, la invención se refiere a cribar, buscar, identificar, desarrollar y evaluar la eficacia de compuestos para la prevención y/o tratamiento de EHNA en un intento de desarrollar nuevos productos médicos así como agentes que inhiben la expresión y/o actividad de Sp1 en hígado y/o los efectos de su expresión.

Antecedentes de la invención

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una enfermedad progresiva del hígado de etiología desconocida caracterizada histológicamente por la acumulación de ácidos grasos, daño a hepatocitos e inflamación parecida a la hepatitis alcohólica. EHNA es una fase crítica en el proceso que abarca desde la esteatosis hepática a cirrosis e insuficiencia hepática. La obesidad y la diabetes de tipo 2 están asociadas con EHNA. Puesto que la prevalencia de estas enfermedades está en aumento, también se espera que aumente la prevalencia de EHNA y por tanto, esta enfermedad se ha convertido en un asunto público emergente en los Estados Unidos [Reid AE. Nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology 2001;121:710-723] así como en otros países [Farell GC. Non-alcoholic steatohepatitis: what is it, and why is it important in the Asia-Pacific region? J Gastroenterol Hepatol 2003;18:124-138].

Se piensa que EHNA se origina de la interacción de muchos genes diferentes y factores del estilo de vida. Se han implicado el deterioro mitocondrial, agresión oxidativa y desregulación metabólica en la patogénesis de la esteatohepatitis.

Como es cierto para otras enfermedades complejas, los factores genéticos que contribuyen al desarrollo de EHNA se pueden identificar más fácilmente combinando estudios en pacientes con EHNA y en modelos animales de la enfermedad. Uno de estos modelos es el ratón deficiente en MAT1A (MAT1A-KO). Estos ratones desarrollan espontáneamente EHNA y carcinoma hepatocelular aproximadamente a los 8 y 15 meses de edad, respectivamente [Lu SC et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 5560-5565 (2001); Martínez-Chantar ML et al. FASEB J 2002]. El gen MAT1A codifica la metionina adenosiltransferasa I y III, las principales enzimas responsables de la síntesis de S-adenosilmetionina (SAMe) en el hígado. Estudios anteriores concluyeron que los pacientes con cirrosis hepática y hepatitis alcohólica son deficientes en la síntesis de SAMe y que el tratamiento con SAMe mejora la supervivencia en pacientes con cirrosis hepática alcohólica.

El diagnóstico temprano de EHNA se ha refrenado por la falta de marcadores tempranos fiables del desarrollo de EHNA. La identificación de genes y proteínas diferencialmente expresados en EHNA con potencial como marcadores biológicos o dianas terapéuticas podría llevar al desarrollo de nuevas herramientas para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de esta enfermedad.

Se ha divulgado un método de diagnóstico de EHNA usando marcadores moleculares basado en la determinación proteómica de un conjunto de proteínas detectadas en muestras de tejido hepático (WO2004/055520).

El solicitante también ha descrito otro método para el diagnóstico de EHNA basado en la identificación de un agrupamiento de 85 marcadores génicos tempranos discriminantes específicos de EHNA en muestras de tejido hepático (de esta manera, constituyen lo que se ha denominado la "firma o huella genómica de EHNA") (EP 04103540.3). La técnica usada en ese caso combina muestras hepáticas de ratones MAT1A-KO y de pacientes con EHNA de fase temprana con métodos bioinformáticos y estadísticos para analizar los datos generados de la determinación del perfil de expresión en todo el genoma de las muestras hepáticas mencionadas, permitiendo así la identificación de un agrupamiento de marcadores génicos tempranos discriminantes de esteatohepatitis en ratones y seres humanos. Entre los genes que comprenden la firma genómica de EHNA hay enzimas (la mayoría son hidrolasas, transferasas y oxidorreductasas), genes de unión a ligandos (unión a metales pesados, unión a nucleótidos, unión a proteínas, receptores y factores de transcripción); transportadores (de hidratos de carbono, transportadores de electrones y transportadores de proteínas); reguladores de apoptosis; chaperonas; factores de coagulación sanguínea y varios genes con función desconocida.

Al buscar la presencia de secuencias consenso para factores de transcripción de vertebrados entre los promotores de los genes enumerados en la tabla 1 (EP 04103540.3), los inventores han encontrado ahora, de forma sorprendente, que sólo el factor de transcripción Sp1 estaba presente significativamente en los promotores de un gran número de los genes enumerados en dicha tabla 1, más de los que se esperaría por casualidad, lo que sugiere que la activación de Sp1 puede estar implicada en los mecanismos subyacentes que producen EHNA.

Sp1 fue uno de los primeros factores de transcripción eucariotas en ser identificado y clonado como un factor que se unía al promotor temprano de SV40 (Dynan y Tjian, Cell 35:79-87, 1983). Es el miembro fundador de una familia de proteínas con dominios de dedo de zinc muy homólogos en la región C-terminal que se unen a cajas GC o GT, mientras que los dominios ricos en glutamina en el N-terminal son esenciales para la activación transcripcional. Sp1 activa la transcripción mediante asociación con uno de los coactivadores asociados con la proteína de unión a TATA (TBP) en el complejo TFIID. Otros papeles sugeridos para Sp1 en procesos nucleares incluyen la remodelación de estructuras de cromatina y el mantenimiento de islas CpG sin metilar. Por tanto, Sp1 es fundamental para el establecimiento de competencia transcripcional, además de su papel como factor de transcripción. En una gran mayoría de promotores que contienen sitios de unión de Sp1, Sp1 proporciona un nivel basal de transcripción. Desempeña un papel importante en la expresión de numerosos elementos de la maquinaria del ciclo celular, tales como ciclinas, proteína similares a Rb y EF2. La desorganización dirigida del gen Sp1 de ratón ha mostrado que Sp1 es crítico para la embriogénesis normal. Los embriones Sp1 (-/-) están gravemente retrasados en su desarrollo y muestran una marcada heterogeneidad en su fenotipo. De forma interesante, la inactivación del gen Sp1 es compatible con un cierto grado de crecimiento y diferenciación celular, y la expresión de varios genes diana putativos, incluyendo la de ciertos genes relacionados con el ciclo celular, no está alterada en embriones Sp1 (-/-). Además, las islas CpG permanecieron sin metilar y se formó cromatina activa en los loci de la globina. Esto puede suceder posiblemente porque otros miembros de la familia Sp1 compensan parcialmente para la ausencia de Sp1, mejorando de esta manera la deficiencia en Sp1. Sp1 está implicado en la expresión basal de genes de la matriz extracelular (MEC) y es importante en procesos fibróticos. De esta manera, el bloqueo de Sp1 inhibe la expresión génica de la MEC lo que se puede usar en el tratamiento de trastornos fibróticos (WO 02/066701).

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el resultado de un análisis de unión in vivo de Sp1 a promotores de genes seleccionados. La inmunoprecipitación de cromatina entrecruzada con formaldehído se llevó a cabo en muestras de tejido hepático de ratones control (tipo salvaje, WT) y en muestras de tejido hepático de ratones MAT1A-KO usando un anticuerpo anti-Sp1 (ejemplo 1). Se hicieron alícuotas de los inmunoprecipitados y posteriormente se analizaron mediante PCR con cebadores específicos para cada promotor de gen. En cada caso, se incluyó una muestra de cromatina total (Carga) en las reacciones de PCR. Sin Ac: sin anticuerpo. Sp1: fracción de inmunoprecipitación. Se incluyó el promotor de a-actina como control negativo.

La figura 2 muestra la fosforilación de Sp1 en tejido hepático de ratón. Se inmunoprecipitó (Ip) extracto crudo total de hígado de ratones WT y MAT1A-KO con un anticuerpo anti-Sp1 y se examinó la presencia de fosfoserina con un anticuerpo anti-fosfoserina (panel superior) o se examinó el...

1. Un método in vitro para detectar esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha afección, que comprende:

en donde un aumento en dicho nivel relativo al del control es indicativo de EHNA.

2. Método según la reivindicación 1, en donde la muestra a ser analizada se toma de un sujeto que no ha sido previamente diagnosticado con EHNA o de un sujeto que ha sido previamente diagnosticado con EHNA o de un sujeto que recibe tratamiento anti-EHNA o de un sujeto que ha recibido previamente tratamiento anti-EHNA.

3. Método según la reivindicación 1, que comprende la extracción de la muestra para obtener un extracto de proteína.

4. Método según la reivindicación 3, en donde la cuantificación de la fosforilación de la proteína Sp1 comprende poner en contacto el extracto de proteína con una composición de uno o más anticuerpos específicos para uno o más epítopos de la proteína Sp1 fosforilada y cuantificar los complejos formados.

5. Método según la reivindicación 4, en donde dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales o policlonales, fragmentos intactos o recombinantes de anticuerpos, combicuerpos y fragmentos de anticuerpo Fab o scFv, específicos para la proteína Sp1 fosforilada, ya sean humanos, humanizados o de origen no humano.

6. Método según las reivindicaciones 4 ó 5, en donde la cuantificación de dichos complejos se realiza mediante inmunotransferencia, ELISA (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas ), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (enzimoinmunoanálisis competitivo), DAS-ELISA (ELISA sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips o micromatrices de proteína que incluyen anticuerpos específicos, ensayos basados en la precipitación de oro coloidal en formatos tales como tiras reactivas; o mediante técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligandos o ensayos de unión a lectina.

7. Uso de una proteína Sp1 fosforilada para diagnosticar in vitro EHNA en un sujeto o para seguir in vitro el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha afección.

8. Un método in vitro para identificar y/o evaluar la eficacia de un agente potencialmente terapéutico contra EHNA, que comprende:

9. Uso de una proteína Sp1 fosforilada en un método in vitro para cribar, identificar, desarrollar y/o evaluar la eficacia de compuesto potencialmente terapéuticos contra EHNA.