SISTEMA DE COEXPRESION ENZIMATICA PARA LA PRODUCCION DE D-AMINOACIDOS.

Sistema de coexpresión enzimática para la producción de D-aminoácidos.

La presente invención se refiere a un vector de coexpresión para la preparación de D-aminoácidos o derivados de D-aminoácidos, a partir de la mezcla racémica de la D,L-5-hidantoína correspondiente y a un sistema enzimático que da lugar a una ruta metabólica nueva de utilidad en dicho procedimiento, que cataliza la conversión estereoselectiva de D,L-5-hidantoína hasta D-aminoácido y la racemización entre los enantiómeros de la misma

Sistema de coexpresión enzimática para la producción de D-aminoácidos.

Sector de la técnica

Esta invención tiene su aplicación en los campos de la industria farmacéutica, la industria química, la industria de los alimentos y la agronomía.

Los D-aminoácidos son el producto directo del procedimiento aquí descrito. Estos compuestos son extremadamente valiosos en la preparación de sustancias farmacológicamente activas. Por ejemplo, la D-fenilglicina y la D-parahidroxifenilglicina son precursores en la síntesis de antibióticos como amoxicilina, ampicilina, aspoxicilina, cefbuperzone, cefpiramide, cefalexin, cefadroxil y otras penicilinas y cefalosporinas; la D-valina está siendo utilizada para la síntesis de pesticidas como el fluvanilato, y la D-alanina es precursora para la síntesis de edulcorantes en la industria alimentaria (Sharna y col. (1999) Current Science, 77,1,127-136).

Estado de la técnica

La síntesis química de aminoácidos naturales o no naturales da lugar a mezclas racémicas de D,L-aminoácidos, que deben ser resueltas hasta sus componentes ópticamente puros antes de ser utilizadas. Existen métodos químicos y biológicos para este proceso y obtener D-aminoácidos razonablemente puros. Estos métodos incluyen la cristalización de sales estereoméricas, cristalización en disolventes ópticamente activos, cromatografía y métodos enzimáticos (Greenstein, J. P. y col. En Chemistry of the amino acids, Krieger Publisher, USA, (1984) 1. 715-759). Todos estos procedimientos tienen muy limitada aplicación industrial debido a su bajo rendimiento, baja rentabilidad y fuerte efecto contaminante del medio ambiente.

Los métodos que han recibido mayor atención en los últimos años son los que parten de hidantoínas monosustituidas en su carbono 5. Estos compuestos pueden ser fácilmente sintetizados por varios métodos; los más importantes son: el de Bucherer-Berg (Finkbeiner, H. J. Org.Chem., (1965) 30, 3414-3419), que utiliza el correspondiente aldehido, cianuro potásico y carbonato amónico. La limitación de este método es su elevada toxicidad. Otro proceso de síntesis importante pero aplicable solo para la p-hidroxifenilglicina, parte de ácido glioxálico, urea y fenol (Ohashi, T., y col. (1981), Agric. Biol. Chem., 45, 831-838). Todos estos procedimientos tienen como resultado una mezcla racémica de hidantoínas D,L-5-monosustituidas, y su transformación química genera una mezcla de la que es difícil y costoso purificar los D-aminoácidos puros. Un ejemplo de ello está en el documento de patente FR 2.310.986. La patente FR 2.317.357 describe un proceso en el que introduce una importante novedad al utilizar una preparación enzimática para hidrolizar una mezcla racémica estereoespecíficamente de D,L-hidantoínas-5-sustituidas, los N-carbamil-D-a-aminoácidos formados son seguidamente oxidados por un método químico. No obstante este procedimiento no es económicamente atractivo desde el punto de vista industrial.

La racemización química espontanea de las hidantoínas 5-sustituidas se realiza en condiciones fuertemente alcalinas por tautomerismo ceto-enólico. La velocidad de racemización depende de la electronegatividad inductiva del susbtituyente del carbono 5. La reacción de racemización de las hidantoínas sustituidas es de primer orden, observándose que el tiempo medio de racemización varía desde 55.9 horas, en el caso de la isopropilhidantoína hasta 16 minutos, en el caso de la fenilhidantoína. Solo esta última y la para-hidroxifenilhidantoína racemizan a una velocidad razonable para ser sometidas a las reacciones de transformación en sus correspondientes D,L-aminoácidos (Bommarius, A.S., y col. (1992) nato asi Ser., Ser. C, 381, 161-174). Por tanto, la inmensa mayoría de hidantoínas D,L-5-sustituidas no racemizan espontáneamente a una velocidad adecuada, alargando y encareciendo la obtención de aminoácidos a partir de ellas.

La producción mediante catalizadores enzimáticos de D-aminoácidos ópticamente puros desde sus mezclas racémicas de hidantoínas D,L-5-sustituidas es un procedimiento más barato y técnicamente simple que los métodos de síntesis química y quimioenzimática descritos, además es menos contaminante (Kim G. J. y col. (1995) Enzyme Microb. Technol.,17, 63-67. Park J. H. y col. (2000) Biotechnol. Prog., 16, 564-570). En esta transformación enzimática, en primer lugar, el anillo de las hidantoínas D,L-5-sustituidas sintetizadas químicamente es hidrolizado por la enzima D-hidatoínasa. Posteriormente, la hidrólisis del D-N-carbamil aminoácido producido es llegada a cabo per la enzima estereoespecífica estricta N-carbamil-D-aminoácido amidohidrolasa (D-carbamilasa). En esta reacción se produce NH3, CO2 y el D-aminoácido correspondiente. Puesto que el sustrato de partida (hidantoína D,L-5-monosustituida) es una mezcla racémica y la transformación es enantioselectiva, el rendimiento de esta reacción para la mayoría de los sustratos es del 50% como máximo. La única aplicación industrial rentable económicamente es la que utiliza D-fenilhidantoína y D-5-para-hidroxi-fenilhidantoína ya que son hidantoínas con una velocidad de racemización espontanea razonablemente rápida (Bommarius, A.S., y col. (1992) nato asi Ser., Ser. C, 381, 161-174. Pietzsch, M. and Syldatk, C. (2002) Enzyme catalysis in organic synthesis. Drauz, K., Waldmann, H., Eds.; Wiley-VCH, Weinheim, 761-799).

Las restricciones a la racemización espontanea de la mayoría de hidantoínas D,L-5-monosustituidas limitan su uso industrial, a pesar del valor económico de sus derivados. Pero estos compuestos pueden ser racemizados rápida y eficientemente por la acción catalítica de la enzima hidantoín racemasa. De tal forma que, la utilización conjunta de esta enzima, la D-hidatoinasa y la D-carbamilasa, permite la transformación total del sustrato, hidantoína D,L-5-monosustituida, en producto, D-aminoácido. Solo dos hidantoín racemasas se han estudiado a nivel bioquímico evaluándose su aplicación a la síntesis de L-aminoácidos. (Watabe, K. y col. (1992) J. Bacteriol. 74, 798q-7995. Wiese, A. y col. (2000) J. Biotechnol., 80, 217-230. Wilms, B. y col. (2001) J. Biotechnol., 86, 19-39).

Los documentos de patente: EP-199.943, EP-309.310, U.S. Pat. No. 4,312,948, ES 2 150 452, describen procedimientos para la obtención de L ó D-aminoácidos por hidrólisis enzimática de hidantoínas D,L-5-monosustituidas, en las cuales las enzimas forman parte del equipo natural de biocatalizadores de microorganismos aislados de medios silvestres. Estos procedimientos presentan dos inconvenientes principales: a) solo son aplicables a hidantoínas D,L-5-monosustituidas que racemicen espontáneamente, por la falta de actividad hidantoín racemasa, y b) baja producción de las enzimas necesarias, dado que están sometidas a sistemas de control de la expresión genética que son desconocidos y por tanto impredecibles.

Para superar este problema los genes de las enzimas implicadas han sido aislados, clonados y expresados. La patente WO9620275, presenta la hidrólisis de D-hidantoínas por una enzima D-hidatoinasa de microorganismos pertenecientes a los genéros Bacillus, Agrobacterium o Pseudomonas, que está producida en E. coli. El documento EP-643.133, se refiere al uso de una D-hidatoinasa recombinante que posee una fuerte termorresistencia. En EP-739.978, se describe la síntesis de N-carbamil-D-aminoácidos por una D-hidatoinasa estable a pH alcalino. Ninguno de estos procedimientos tiene aplicación industrial por si solo, ya que carecen de la enzima con actividad D-carbamilasa que permite la producción de D-aminoácidos. El mismo problema se plantea en el documento ES 2 159 527, en el que solo se incluye en el organismo recombinante productor a la D-carbamilasa, siendo necesario empezar la síntesis de D-aminoácidos desde D-carbamil-aminoácidos, lo que es económicamente inviable.

Otros procedimientos posteriores han incluido la actividad de las enzimas codificadas por los genes de la D-hidatoinasa y la D-carbamilasa. Concretamente la patente WO 94/00577 describe la producción de D-aminoácidos desde hidantoínas D,L-5-monosustituidas por producción de D-hidatoínasa y D-carbamilasa en E. coli y en células del propio género Agrobacterium. Esta estrategia permite incrementar la cantidad soluble de estas proteínas y controlar su producción mediante la inducción de los promotores de los vectores recombinantes utilizados. En la patente WO9600296 se da un paso adelante en la técnica al inmovilizar las dos proteínas en una columna de tipo cromatográfico. Esta novedad es de gran aplicación industrial, al facilitar la purificación del enantiomero...

1. Sistema de coexpresión enzimática caracterizado por una molécula plasmídica portadora que comprende al menos tres secuencias nucleotídicas, controladas por el promotor Lac y la transcripción y la traducción por células de E. Coli.

2. Sistema de coexpresión enzimática según reivindicación 1 donde las secuencias nucleotídicas están codificadas por la enzima D-hidantoinasa de Agrobacterium tumefaciens BQL9, D-carbamilasa de Agobacterium tumefaciens BQL9 y la enzima hidantoín racemasa de Agrobacterium tumefaciens C58.

3. Sistema de coexpresión enzimática según reivindicación 1 y 2 denominado pSER42, caracterizado por estar compuesto por un plásmido de transformación y expresión en E. coli, que contiene entre la zona promotora del operon Lac y la zona terminadora, en primer lugar el gen D-carbamilasa, seguido por el gen hidantoín racemasa y por ultimo por el gen hidantoinasa. Cada gen comienza con un inicio de la traducción (ATG) y finaliza con un triplete de parada de la traducción (TAA). Corriente arriba de cada gen existe un sitio de unión a ribosomas, que dista 10 nucleótidos del ATG de inicio de la traducción. Los tres genes se transcriben como un ARN mensajero policistrónico.

4. Procedimiento para la preparación del sistema de coexpresión enzimática según reivindicación 1-3 por sobre-expresión genética en microorganismos transformados con los genes de hidantoína racemasa, D-hidantoinasa y D-carbamilasa, caracterizado porque comprende las etapas de construcción de una factoría celular de E. coli portadora de D-hidantoinasa y D-carbamilasa de Agrobacterium tumefaciens BQL9 e hidantoín racemasa de Agrobacterium tumefaciens C58; clonación de los mismos en el plásmido pSER42; expresión de estos genes conjuntamente para constituir un sistema enzimático capaz de transformar todas las moléculas de una mezcla racémica de hidantoinas D,L-5-monosustituidas en su correspondiente D-aminoácido.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende las etapas de sobre-expresión en células de microorganismos que son obtenidos por transformación con plásmidos portadores de los genes de dichas enzimas y cultivo de las mismas en un medio derivado del medio LB (Luria-Bertani), con suplemento de MnCl2 para mejorar la actividad de la D-hidantoinasa.

6. Un procedimiento según las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque los microorganismos hospedadores utilizados son Escherichia coli transformados con el plásmido pSER42.

7. Un procedimiento para la preparación de D-aminoácidos por conversión estereoselectiva y completa de una mezcla racémica de hidantoína D,L-5-monosustituida, en donde la reacción es catalizada por medio del sistema enzimático según las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque comprende incubar proporciones definidas de dicho sistema enzimático y de una mezcla racémica acuosa de una hidantoína D,L-5-monosustituida; y recuperar el D-aminoácido correspondiente por métodos estándar y viables industrialmente. La hidantoín racemasa componente de dicho sistema enzimático es capaz de catalizar la conversión entre los enantiómeros ópticamente activos de las hidantoinas D,L-5-monosustituidas, donde el grupo sustituyente tiene entre uno y nueve átomos de carbono y puede contener grupos sulfidrilo, amínicos, carboxilicos, imidazol, aromáticos sustituidos o no y amídicos. Dichas hidantoinas D,L-5-monosubstituidas están caracterizadas porque no tienen que presentar racemización espontánea. Aunque el hecho de que la presenten no restringe su aplicación en esta invención.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la reacción de conversión se lleva a cabo usando una relación en peso de biomasa húmeda de mezcla enzimática/hidantoinas D,L-5-monosustituidas comprendida entre 1:10 y 1:50, a un intervalo preferente de temperatura de 50 á 60ºC y a un intervalo preferente de pH de 8.8 á 9.7.

9. Uso del sistema de coexpresión enzimática según reivindicación de 1-8 para la preparación selectiva y exclusiva de D-aminoácidos o derivados de los mismos.