PROCEDIMIENTO PARA SEPARAR VARIANTES DE ROTAVIRUS Y VACUNA DE ROTAVIRUS ATENUADO VIVO.

Un rotavirus reordenante que comprende al menos un antígeno o al menos un segmento o parte de un segmento de la variante de rotavirus denominada P43 y depositada en la ECACC con el número de acceso 99089301,

la descendencia del rotavirus y derivados inmunológicamente activos del mismo y materiales obtenidos a partir de los mismos, y en el que dicha variante se define por una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una de las proteínas virales principales denominadas VP4 y VP7

Procedimiento para separar variantes de rotavirus y vacuna de rotavirus atenuado vivo.

La presente invención se refiere a nuevas formulaciones de vacuna, a procedimientos para prepararlas y a su uso en terapia. En particular, la presente invención se refiere a nuevas formulaciones de vacunas de rotavirus.

La diarrea infecciosa aguda es una causa destacada de enfermedad y muerte en muchas áreas del mundo. En los países en desarrollo el impacto de la enfermedad diarreica es asombroso. En Asia, África y Latinoamérica se ha estimado que hay entre 3 y 4 billones de casos de diarrea cada año y de estos casos aproximadamente de 5 a 10 millones ocasionan la muerte (Walsh, J. A. y col.: N. Engl. J. Med., 301: 967-974 (1979)).

Los rotavirus se han reconocido como una de las causas más importantes de diarrea severa en lactantes y en niños pequeños (Estes, M. K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Tercera Edición, editado por Fields y col., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Se estima que la enfermedad por rotavirus es responsable de más de un millón de muertes al año. La mayoría de las veces, la enfermedad inducida por rotavirus afecta a niños con edades comprendidas entre 6 y 24 meses y la prevalencia máxima de la enfermedad generalmente se produce durante los meses más fríos en los climas templados y en todo el año en las áreas tropicales. Los rotavirus típicamente se transmiten de una persona a otra por vía fecal-oral con un periodo de incubación de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 días. A diferencia de la infección en el grupo de edad de 6 meses a 24 meses, los recién nacidos generalmente son asintomáticos o tienen sólo la enfermedad leve. A diferencia de la enfermedad severa encontrada normalmente en niños pequeños, la mayoría de los adultos están protegidos como resultado de una infección previa por rotavirus, de manera que la mayoría de las infecciones en adultos son leves o asintomáticas (Offit, P. A. y col. Comp. Ther., 8(8): 21-26, 1982).

Los rotavirus generalmente son esféricos y su nombre se debe a su estructura de cápsida de doble cubierta externa e interna característica. Típicamente, la estructura de cápsida de doble cubierta de un rotavirus rodea a una cubierta de proteína interna o núcleo que contiene el genoma. El genoma de un rotavirus se compone de 11 segmentos de ARN bicatenario que codifica al menos 11 proteínas virales distintas. Dos de estas proteínas virales denominadas VP4 y VP7 están dispuestas en el exterior de la estructura de la cápsida de doble cubierta. La cápsida interna del rotavirus presenta una proteína, que es la proteína del rotavirus denominada VP6. La importancia relativa de estas tres proteínas rotavirales particulares en la inducción de la respuesta inmune que sigue a la infección por rotavirus aún no está clara. Sin embargo, la proteína VP6 determina el antígeno del grupo y subgrupo, y las proteínas VP4 y VP7 son determinantes de la especificidad de serotipo.

La proteína VP7 es una glicoproteína con un peso molecular (PM) de 38.000 (34.000 cuando no está glicosilada), que es el producto de traducción del segmento genómico 7, 8 ó 9, dependiendo de la cepa. Esta proteína estimula la formación del anticuerpo neutralizante principal después de la infección por rotavirus. La proteína VP4 es una proteína no glicosilada con un peso molecular (PM) de aproximadamente 88.000 que es el producto de traducción del segmento genómico 4. Esta proteína también estimula anticuerpos neutralizantes después de la infección por rota- virus.

Como las proteínas VP4 y VP7 son las proteínas virales contra las cuales se dirigen los anticuerpos neutralizantes, se cree que son los candidatos principales para el desarrollo de vacunas de rotavirus, produciendo protección contra la enfermedad por rotavirus.

La infección natural por rotavirus durante las primeras fases de la infancia se sabe que induce inmunidad protectora.

Por lo tanto, es muy deseable una vacuna de rotavirus atenuado vivo. Preferentemente, ésta debería ser una vacuna oral, ya que ésta es la vía natural de infección del virus.

Las primeras fases del desarrollo de la vacuna para prevenir infecciones por rotavirus empezaron en la década de los 70 después de descubrimiento del virus. Inicialmente se estudiaron cepas atenuadas de animales y humanos y tuvieron resultados mixtos o decepcionantes. Los esfuerzos más recientes se han centrado en reordenantes humano-animal que han sido más satisfactorios.

Una cepa de rotavirus conocida como 89-12 se ha descrito por Ward; véase la Patente de Estados Unidos Número 5.474.773 y Bernstein, D. L. y col, Vaccine, 16 (4), 381-387, 1998. La cepa 89-12 se aisló a partir de una muestra de heces recogida de un niño de 14 meses con enfermedad natural por rotavirus en 1988. De acuerdo con la Patente de Estados Unidos Número 5.474.773, el rotavirus humano HRV 89-12 después se adaptó al cultivo por 2 pases en células primarias de Riñón de Mono Verde Africano (AGMK) y 4 pases en células MA-104 como se describe por Ward en J. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984. Después se purificó en placa 3 veces en células MA-104 (hasta el pase 9) y se cultivo después de 2 pases adicionales en estas células. Se realizó un pase adicional (pase 12) para la deposición en la ATCC con en número de acceso ATCC VR 2272. La cepa depositada se conoce como 89-12C2.

Más adelante se hace referencia al documento de 1998 en Vaccine de Bernstein y col como el documento Vaccine (1998). El documento describe la seguridad e inmunogenicidad de un candidato de vacuna viva de rotavirus humano administrada por vía oral. Esta vacuna se obtuvo a partir de la cepa 89-12, atenuada por pases sin purificación en placas 26 veces en células AGMK primarias y otras 7 veces en una línea celular AGMK establecida (33 pases en total).

En lo sucesivo, en la presente memoria se hará referencia al material mencionado anteriormente que se ha sometido a pases en serie 26 veces como P26 y al material que se ha sometido a pases en serie 33 veces como P33. En general, se hará referencia al rotavirus obtenido por pases 89-12 n veces como Pn.

En los ejemplos que se proporcionan más adelante el material P33 se sometió a pases 5 veces más en células Vero. Se hace referencia a este material como P38.

Los aislados de P26 y P33 descritos en el documento Vaccine (1998) no se depositaron en una colección de cultivos, ni se analizaron para establecer su caracterización genética.

Ahora se ha descubierto que la población de P26 descrita en la bibliografía comprende una mezcla de variantes. Esto se ha establecido por caracterización genética como se describe más adelante en la presente memoria (véanse los ejemplos). Por lo tanto, P26 no es una población constante fiable para pases adicionales, en particular para la producción de lotes de vacuna. De forma similar, P33 comprende una mezcla de variantes y no es constante de forma fiable para la producción de lotes de vacuna.

Se ha descubierto que el material P26 es una mezcla de al menos tres variantes génicas de VP4. De manera similar, P33 y P38 son una mezcla de dos variantes. Estas variantes parecen ser antigénicamente diferentes, en términos de epítopes de neutralización, a la cepa 89-12C2 depositada en la ATCC cuando se evalúan los títulos de anticuerpos neutralizantes de sueros procedentes de lactantes vacunados con P33 contra estas variantes. Esto se ilustra en la Figura 3.

Además, se ha descubierto que cuando el material P33 se administra a lactantes, se replican y excretan dos variantes identificadas. De 100 lactantes vacunados, sólo 2 mostraron signos de gastroenteritis debida a infección por rotavirus, mientras que se infectó el 20% de un grupo de placebo. Estos hallazgos sugieren que las variantes identificadas están asociadas con protección frente a la enfermedad por rotavirus.

La presente invención proporciona un procedimiento para separar variantes de rotavirus y una vacuna de rotavirus atenuado vivo mejorada derivada de una cepa de rotavirus humana clonada (homogénea).

Por consiguiente, de acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona una población de rotavirus atenuado (aislado), caracterizada por el hecho de que comprende una sola variante o sustancialmente una sola variante, estando dicha variante definida por la secuencia de nucleótidos que codifica al menos una de las proteínas virales principales denominadas VP4 y VP7.

Preferentemente, la población de rotavirus de acuerdo con la invención es una variante...

1. Un rotavirus reordenante que comprende al menos un antígeno o al menos un segmento o parte de un segmento de la variante de rotavirus denominada P43 y depositada en la ECACC con el número de acceso 99089301, la descendencia del rotavirus y derivados inmunológicamente activos del mismo y materiales obtenidos a partir de los mismos, y en el que dicha variante se define por una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una de las proteínas virales principales denominadas VP4 y VP7.

2. Un rotavirus reordenante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la variante sustancialmente individual es una variante en la que el gen de VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una de las siguientes: una base adenina (A) en la posición 788, una base adenina (A) en la posición 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación.

3. Un rotavirus reordenante de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el gen de VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una base adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación.

4. Un rotavirus reordenante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la variante sustancialmente individual es una variante en la que el gen de VP7 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una de las siguientes: una timina (T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897 y una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de iniciación.

5. Un rotavirus reordenante de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el gen de VP7 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) o una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de iniciación.

6. Un rotavirus reordenante de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el gen de VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación; y el gen de VP7 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) en la posición 897 desde el codón de iniciación.

7. Un rotavirus reordenante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VP4 en el que la secuencia de nucleótidos es como se muestra en la Figura 1, y/o una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VP7 en la que la secuencia de nucleótidos es como se muestra en la Figura 2.

8. Un rotavirus reordenante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el segmento o segmento parcial que codifica NSP4 es un segmento o un segmento parcial de P43.

9. Una composición de vacuna que comprende un rotavirus reordenante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 mezclado con un vehículo o adyuvante farmacéutico adecuado.

10. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, adaptada para administración oral.

11. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el rotavirus reordenante se formula con una composición de antiácido.

12. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la composición de antiácido comprende un antiácido orgánico.

13. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el antiácido es citrato sódico.

14. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la composición de antiácido comprende un antiácido inorgánico.

15. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el antiácido es hidróxido de aluminio.

16. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el antiácido es carbonato cálcico.

17. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende además un agente viscoso.

18. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 17, en la que el agente viscoso es goma xantana.

19. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-16, en la que el rotavirus reordenante se formula con carbonato cálcico y goma xantana y se reconstituye con solución acuosa.

20. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en la que el rotavirus reordenante se formula con la composición de antiácido y se liofiliza en un blíster.

21. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, en la que el virus está en forma liofilizada.

22. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 21, en la que el rotavirus reordenante y la composición de antiácido están presentes en recipientes separados para formulación como una composición de vacuna líquida antes de la administración.

23. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 21, en la que el rotavirus reordenante y la composición de antiácido están presentes en el mismo recipiente para la formulación como una composición de vacunan liofilizada a reconstituir con una solución acuosa antes de la administración.

24. Un procedimiento de fabricación de una vacuna de rotavirus que comprende mezclar un rotavirus reordenante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 con un antiácido y un agente viscoso.

25. Un procedimiento para fabricar una vacuna de rotavirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 23 que comprende mezclar un rotavirus reordenante con un vehiculo o adyuvante farmacéutico adecuado.

26. Uso de un rotavirus reordenante en la preparación de una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 23 para la prevención de la infección por rotavirus en un sujeto humano.

27. Una formulación de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 23 para uso en medicina.