RECOMBINACION DE ADN ESPECIFICO DE SECUENCIA EN CELULAS EUCARIOTAS.

Procedimiento para la recombinación específica de secuencia de ADN en una célula eucariota in vitro que comprende

a) la introducción en una célula de una primera secuencia de ADN que comprende:

una secuencia attB según SEQ ID Nº:1 o su homólogo, o

una secuencia attP según SEQ ID Nº:2 o su homólogo, o

una secuencia attL según SEQ ID Nº:3 o su homólogo, o

una secuencia attR según SEQ ID Nº:4 o su homólogo,

b) la introducción de una segunda secuencia de ADN en la célula que comprende:

una secuencia attB según SEQ ID Nº:1 o su homólogo, o

una secuencia attP según SEQ ID Nº:2 o su homólogo, o

una secuencia attL según SEQ ID Nº:3 o su homólogo, o

una secuencia attR según SEQ ID Nº:4 o su homólogo, y

c) la realización de la recombinación específica de secuencia mediante la acción de una integrasa Int del bacteriófago lambda,

designando el término homólogo secuencias attB, attP, attL y attR que son idénticas al menos en el 70% en comparación con las secuencias de recombinación de origen natural

Recombinación de ADN específico de secuencia en células eucariotas.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la recombinación específica de secuencia de ADN en células eucariotas in vitro que comprende la introducción en una célula de una primera secuencia de ADN que comprende una secuencia attB según SEQ ID Nº:1 o su homólogo, o una secuencia attP según SEQ ID Nº:2 o su homólogo, o una secuencia attL según SEQ ID Nº:3 o su homólogo, o una secuencia attR según SEQ ID Nº:4 o su homólogo, la introducción de una segunda secuencia de ADN en la célula que comprende una secuencia attB según SEQ ID Nº:1 o su homólogo, o una secuencia attP según SEQ ID Nº:2 o su homólogo, o una secuencia attL según SEQ ID Nº:3 o su homólogo, o una secuencia attR según SEQ ID Nº:4 o su homólogo, y la realización de la recombinación específica de secuencia mediante la acción de una integrasa Int del bacteriófago lambda, designando el término "homólogo" secuencias attB, attP, attL y attR que son idénticas al menos en el 70% en comparación con las secuencias de recombinación de origen natural. Una forma de realización preferida se refiere a un procedimiento que comprende además la realización de una segunda recombinación específica de secuencia de ADN mediante la acción de una Int y de un factor Xis.

La manipulación controlada del genoma eucariota es un procedimiento importante para estudiar la(s) función(es) de determinados genes en el organismo vivo. Además de esto desempeñan una función en el procedimiento de terapia génica en el campo de la medicina. La preparación de cepas animales transgénicas, la modificación de genes o recortes de genes (denominados "genes diana") y la integración dirigida de ADN extraño en el genoma de eucariotas superiores son de especial importancia a este respecto. Mediante la caracterización y el uso de sistemas de recombinación específicos de secuencia pudieron mejorarse estas tecnologías en los últimos tiempos.

Las recombinasas de ADN específicas de secuencia conservativas se clasifican en dos familias.

Los miembros de la primera familia, la denominada familia de la "integrasa", catalizan la separación y reconexión de hebras de ADN entre dos secuencias de nucleótidos definidas, que se designan en lo sucesivo secuencias de recombinación. Estas pueden encontrarse o bien sobre dos moléculas de ADN distintas o bien sobre una. Entonces se produce la recombinación inter- o intramolecular. En el último caso el resultado depende de la reacción de la disposición respectiva de las secuencias de recombinación unas respecto a otras. Si las secuencias de recombinación se encuentran en orientación inversa, es decir, opuestas unas respecto a otras, se produce la inversión del segmento de ADN que se encuentra entre ellas. Si las secuencias de recombinación se encuentran como repeticiones directas, es decir, en paralelo, sobre un sustrato de ADN, se produce la deleción. En la recombinación intermolecular, es decir, cuando las dos secuencias de recombinación están situadas sobre dos moléculas de ADN distintas, puede producirse una fusión de las dos moléculas de ADN. Mientras que los miembros de la familia de la integrasa catalizan normalmente tanto la recombinación intra- como la intermolecular, las recombinasas de la segunda familia, las denominadas "invertasas/resolvasas", sólo pueden efectuar la recombinación intramolecular.

Las recombinasas que actualmente se usan principalmente para la manipulación de genoma eucariota pertenecen a la familia de la integrasa. Éstas son la recombinasa Cre del bacteriófago P1 y la recombinasa Flp de levaduras; véase Müller, U. (1999) Mech. Develop., 82, página 3. Las secuencias de recombinación a las que se une la recombinasa Cre se designan loxP. loxP es una secuencia de nucleótidos de 34 pb (pares de bases) de longitud que está constituida por dos secuencias de nucleótidos invertidos de 13 pb de longitud y un espaciador de 8 pb de longitud que se encuentra entre ellas; véase Hoess, R. y col. (1985) J. Mol. Biol., 181, página 351. Las secuencias de unión para Flp, designadas FRT, se construyen de forma similar, pero se diferencian de loxP; véase Kilby, J. y col. (1993) Trends Genet., 9, página 413. Por tanto, las secuencias de recombinación no pueden intercambiarse unas con otras, es decir, Cre no puede recombinar secuencias FRT y FLP tampoco secuencias loxP. Ambos sistemas de recombinación son activos en amplias distancias, es decir, el segmento de ADN que se va a invertir o delecionar, flanqueado por dos secuencias loxP o FRT, puede ser de más de 10.000 pares de bases (kb) de longitud.

Con estos dos sistemas se produjo, por ejemplo, la recombinación específica del tejido en el modelo de ratón, la translocación cromosómica en plantas y animales, y una inducción controlada de la expresión génica; véase el artículo de revisión de Müller, U. (1999) Mech. Develop., 82, página 3. De este modo se delecionó el gen de la ADN polimerasa ß en determinado tejidos del ratón; véase Gu, H. y col. (1994) Science, 265, página 103. Otro ejemplo es la activación específica del oncogén del virus del tumor de ADN SV40 en las pupilas de los ojos del ratón, que condujo a la formación de tumor exclusivamente en estos tejidos. Además, la estrategia Cre-loxP también se usó en relación con los promotores inducibles. Para ello se reguló, por ejemplo, la expresión de la recombinasa con un promotor inducible por interferón, lo que condujo a la deleción de un gen determinado en el hígado y no -o sólo mínimamente- en otros tejidos; véase Kühn, R. y col. (1995) Science, 269, página 1427.

Hasta ahora se han usado dos miembros de la familia de la invertasa/resolvasa para la manipulación del genoma eucariota. Un mutante del gen de la invertasa de bacteriófagos Mu puede catalizar sin cofactores la inversión de un fragmento de ADN en protoplastos vegetales. Sin embargo, se comprobó que este mutante es hiperrecombinante, es decir, también cataliza separaciones de hebras de ADN distintas de sus secuencias de recombinación naturales. Esto conduce a resultados de recombinación espontáneos parcialmente letales en el genoma de protoplastos vegetales. La ß-recombinasa de Streptococcus pyogenes cataliza la recombinación entre dos secuencias de recombinación directamente repetidas en cultivos celulares de ratón, lo que conduce al recorte del segmento. Sin embargo, además de la deleción también se detectó la inversión, con lo que el uso controlado de este sistema es apto para la manipulación del genoma eucariota.

La manipulación del genoma eucariota con la recombinasa Cre o Flp también presenta desventajas considerables. En la deleción, es decir, la recombinación de dos secuencias de recombinación loxP o FRT presentes repetidamente de forma directa en un genoma, se produce la pérdida irreversible del segmento de ADN que se encuentra entre ellas. Si sobre este segmento de ADN se encuentra un gen, en consecuencia éste se va perder para siempre en la célula y en el organismo. Por tanto, no es posible la reproducción del estado original para un nuevo análisis de la función del gen en estas células, por ejemplo, en un estadio de desarrollo tardío del organismo. La pérdida definitiva del segmento de ADN mediante deleción puede evitarse mediante la inversión del segmento de ADN en cuestión. Con esto podría inactivarse un gen sin que llegue a perderse, y conectarse de nuevo en un momento posterior en el desarrollo o en el animal adulto mediante una expresión regulable temporalmente de la recombinasa mediante una recombinación inversa. Sin embargo, la desventaja en el uso de la recombinasa Cre o Flp en este procedimiento modificado se basa en que no puede regularse la inversión ya que las secuencias de recombinación no se cambian con el proceso de recombinación. En consecuencia se producen procesos de recombinación repetidos en los que la inactivación del gen en cuestión es provocada por la inversión del segmento de ADN en cuestión en sólo algunas, máximo el 50%, de las células diana. Se ha intentado resolver este problema al menos parcialmente construyendo secuencias loxP mutadas que ya no pueden usarse después de la recombinación única para otras reacciones. Sin embargo, a este respecto, la desventaja se encuentra en la unicidad de la reacción, es decir, después de la inactivación de un gen mediante inversión ya no puede realizarse una activación posterior mediante la recombinación inversa.

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1. Procedimiento para la recombinación específica de secuencia de ADN en una célula eucariota in vitro que comprende