QUIMICA DE SUPERFICIE DE CULTIVOS CELULARES.

Un aparato para el cultivo de materiales biológicos, comprendiendo el aparato un substrato no fibroso para la unión de materiales biológicos,

preparado el substrato a partir de una mezcla de resina plástica polímera y moléculas anfipáticas (10), en el que las moléculas anfipáticas comprenden un resto hidrófilo (14) y una región hidrófoba (16), caracterizado porque las regiones hidrófobas (16) están ancladas dentro del substrato y los restos hidrófilos (14) están expuestas sobre el substrato

Un procedimiento y aparato para cultivar células y otros materiales biológicos.

La capacidad para desarrollar y estudiar diversos materiales biológicos, tales como células de mamíferos, es importante en el laboratorio y la industria. Sin embargo, muchas células y otros materiales biológicos se desarrollarán únicamente si pueden unirse a un substrato apropiado (es decir, el material biológico muestra un fenotipo adherente). La capacidad de muchos materiales biológicos para unirse y desarrollar sobre un substrato depende del substrato que está siendo químicamente activado para hacerlo de alguna manera hidrófilo. La hidrofilicidad puede ser proporcionada por diversos grupos funcionales sobre el substrato. Estos grupos funcionales incluyen, por ejemplo, grupos hidroxilo (OH), carboxilo (COOH), y amina (NH2 y NH).

La preparación de un substrato químicamente activado de este tipo implica, generalmente (1) la aplicación de energía en la forma de descarga de o bien corona o bien plasma al substrato, o (2) la aplicación de un recubrimiento (tal como poli-D-lisina o colágeno) al substrato. Estos procedimientos proporcionan grupos a los cuales pueden unirse materiales biológicos. Por ejemplo, en la descarga corona, el substrato que está siendo tratado se expone a una descarga eléctrica, o corona. Las moléculas de oxígeno comprendidas dentro del área de descarga se rompen un su forma atómica y quedan libre para unirse a los extremos de las moléculas del substrato que está siendo tratado, dando como resultado un substrato químicamente activado deseado. La principal ventaja del tratamiento de descarga corona o de plasma de substratos es la facilidad de fabricación; los substratos poliméricos sometidos a dicha descarga energética pueden ser tratados fácilmente en línea y esterilizados.

Sin embargo, tanto los tratamientos de descarga corona como de plasma tienen inconvenientes. Por ejemplo, la descarga corona está limitada a la unión de oxígeno dentro de los primeros pocos nanómetros del substrato, y puede ser anulada. En consecuencia, el substrato puede degradarse rápidamente. Adicionalmente, el tratamiento de descarga corona puede generalmente proporcionar únicamente hasta aproximadamente 20%, en el mejor de los casos, de oxígeno de superficie sobre el substrato. Ciertos materiales biológicos, tales como ciertas líneas de células, requieren más oxígeno. Mientras que la descarga de plasma puede producir niveles de plasma más altos que la descarga corona, requiere que el substrato a tratar esté en un vacío.

El tratamiento de substratos mediante la aplicación de diversos recubrimientos biológicos, tal como poli-D-lisina o colágeno, imitan el medio sobre el cual las células típicamente se desarrollarían. Sin embargo, estos recubrimientos frecuentemente no sobreviven a la esterilización mediante radiación gamma. Adicionalmente, el origen biológico de estos recubrimientos aumenta la posibilidad de transmisión de enfermedades.

Los tratamientos de descarga energética y de recubrimiento pueden proporciona únicamente unos pocos substratos activados convencionales para uso con todos los materiales biológicos, que producen pequeña variación en la química de superficie de substratos usados para cultivas materiales biológicos. Esto es problemático dado que, en algún grado, cada línea de células u otro material biológico muestra una preferencia por un cierto tipo, mezcla, y/o proporción de grupos funcionales sobre un substrato de cultivo. Por ejemplo, algunos muestran una preferencia por múltiples grupos funcionales diferentes, en tanto que algunos muestran una preferencia por únicamente un grupo funcional en un intervalo de concentración específico. Sin embargo, tal como se ha descrito anteriormente, las tecnologías actuales usan generalmente estrategias de “talla única” (por ejemplo, un substrato con tratamiento corona usado para todos los tipos de líneas de células). En el mejor de los casos, los substratos resultantes pueden controlarse para producir una gama de química de superficie, en lugar de de ser capaces de producir cualquier química. Por ejemplo, el tratamiento corona, incluso a baja potencia, tiene una química de superficie característica que de alguna forma depende de las condiciones atmosféricas en el momento (humedad, temperatura, y productos orgánicos volátiles en el aire). Finalmente, generalmente produce un substrato que tiene un intervalo de concentraciones de oxígeno de entre 10%-20%. Sin embargo, no puede producir substratos que tengan altas concentraciones de oxígeno, ni tampoco puede producir substratos que incluyan otros grupos o grupos funcionales adicionales, tales como grupos amina. Un substrato de este tipo puede no ser adecuado para un material biológico particular que muestre una preferencia por altos niveles de oxígeno y/o grupos amina.

Además, muchos materiales biológicos se desarrollan en aparatos de cultivo que no solamente tienen substratos tratados tal como se ha descrito anteriormente, sino que demás incluyen suero para potenciar el desarrollo. Por ejemplo, la línea de células de riñón embriónico humano (HEK) 293 se usa de manera creciente dado que es fácil de desarrollar, es genéticamente estable, tiene un complemento normal de cromosomas humanos, e incorpora porciones del genoma de adenovirus que la hace adecuada para manipulación genética. Otras líneas de células que muestran características similares son PER C6, Vero, BHK-21, y MDCK.

Las células HEK pueden desarrollarse con éxito bajos condiciones recomendadas por la American Type Culture Collection (ATCC) (por ejemplo, en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de suero bovino fetal (FBS)) sobre substratos de cultivo de células convencional (por ejemplo, los sometidos a tratamiento corona). El suero potencia el desarrollo de células HEK y como tal, se ha incluido en la mayoría de los procedimientos de cultivo de células. Sin embargo, recientemente, se han incrementando las normas de seguridad concernientes y este es el componente individual el más costoso de la mayoría de las formulaciones de medios. Aunque es deseable reducir o eliminar la necesidad de suero completamente, la capacidad de casi la totalidad de las líneas de células, incluyendo las células HEK, para desarrollarse sobre substratos tratados con corona disminuye conforme se reduce la concentración de suero.

Recientemente, el producto CellBIND® de Corrning, está siendo ofrecido en todos los formatos de cultivo de células convencionales. El CellBIND® incluye un substrato descrito como soporte del desarrollo de células adherentes sin suero. Se ha sugerido que la capacidad potenciada del CellBIND® para desarrollar células HEK es fundamentalmente un resultado de su cantidad superior de oxígeno, específicamente grupos hidroxilo, con relación a los substratos tratados con corona (15% de oxígeno sobre CellBIND® frente a 8% de oxígeno sobre substratos tratados con corona) y a un menor pero aún significativo grado por la cantidad de ácidos carboxílicos (7% de ácido carboxílico en CellBIND® frente a 2% de ácido carboxílico sobre substratos tratados con corona). Sin embargo, el CellBIND® no incluye otros grupos funcionales tales como grupos amina, y no está fabricado a medida para diferentes preferencias que puedan ser mostradas por diferentes materiales biológicos.

Son deseables otros productos y procedimientos. Por ejemplo, sería deseable un aparato y procedimiento para controlar la química de un substrato adherente sin tratamiento secundario (por ejemplo, descarga corona) y/o para mejorar la calidad de tratamientos secundarios existentes. Además, sería deseable un aparato que incluya grupos funcionales sobre un substrato polimérico que no esté sujeto a degradación y pueda usarse con suero reducido o sin suero. Además, sería deseable un procedimiento de preparación de un aparato que tenga un substrato que varíe en grupos funcionales, tanto en el tipo como en la concentración, con el fin de fabricar a medida el aparato para un material biológico particular.

El Documento WO2004 10440123, divulga polímeros cuyas superficies están modificadas mediante grupos finales que incluyen restos que modifican las superficies anfipáticas. La modificación se logra mediante la reordenación de manera espontánea de los grupos finales anfipáticos de sus posicionamientos en el cuerpo polímero para posicionar un resto sobre la superficie del cuerpo, dependiendo de la composición del medio con el cual está en contacto el cuerpo, cuando dicho re-posicionamiento ocasiona una reducción en la energía interfacial. Se muestra un ejemplo de un...

1. Un aparato para el cultivo de materiales biológicos, comprendiendo el aparato un substrato no fibroso para la unión de materiales biológicos, preparado el substrato a partir de una mezcla de resina plástica polímera y moléculas anfipáticas (10), en el que las moléculas anfipáticas comprenden un resto hidrófilo (14) y una región hidrófoba (16), caracterizado porque las regiones hidrófobas (16) están ancladas dentro del substrato y los restos hidrófilos (14) están expuestas sobre el substrato.

2. El aparato de la reivindicación 1, en el que la resina de la mezcla está recubierta con las moléculas anfipáticas (10).

3. El aparato de la reivindicación 1, en el que la resina de la mezcla está compuesta con las moléculas anfipáticas (10).

4. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que los restos hidrófilos (14) están seleccionados entre hidroxilos, carboxilos, aminas, o mezclas de los mismos.

5. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que el polímero plástico está seleccionado entre poliestireno, polipropileno, tereftalato de polietileno modificado con glicol (PETG), tereftalato de polietileno (PET), policarbonato, o mezclas de los mismos.

6. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que las moléculas anfipáticas

(10) están mezcladas con la resina plástica polímera en una proporción de aproximadamente 1% p/p.

7. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las moléculas anfipáticas (10) están mezcladas con la resina plástica polímera en una proporción de aproximadamente 0,1% p/p.

8. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que la superficie está tratada además con descarga corona o descarga de plasma.

9. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que la superficie está recubierta además con poli-D-lisina o colágeno.

10. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que la región hidrófoba (16) es una cadena de átomos de carbono unidos que tiene una longitud de entre 10 hasta 30 átomos de carbono.

11. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que los materiales biológicos tienen un fenotipo adherente.

12. El aparato de la reivindicación 11, en el que los materiales biológicos están seleccionados entre el grupo constituido por células, orgánulos, estructuras subcelulares, virus, bacterias, biomoléculas, y combinaciones de las mismos.

13. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que las moléculas anfipáticas (10) están elegidas entre etoxilato de alquilamina, polietilenoimina, octildecamina, o mezclas de las mismas.

14. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que las moléculas anfipáticas (10) no incluyen fluorocompuestos.

15. Un procedimiento de obtención de un aparato para el cultivo de materiales biológicos, comprendiendo el procedimiento la determinación de un tipo de grupo funcional hidrófilo que facilita la asociación con un material biológico de un fenotipo adherente, la selección de una molécula anfipática (10) que incluye regiones hidrófilas e hidrófobas (16), incluyendo la región hidrófila dicho grupo funcional hidrófilo (14), el mezclado de una pluralidad de dichas moléculas anfipáticas (10) con una resina plástica polímera para formar una resina mezclada, y la preparación de un aparato para el cultivo del material biológico a partir de dicha resina mezclada que comprende un substrato formado a partir de la resina mezclada, caracterizado porque las regiones hidrófobas (16) están ancladas dentro del substrato y los grupos de funciones hidrófilas (14) están expuestos sobre el substrato.

16. El procedimiento de la reivindicación 15 que comprende además la determinación de una concentración del grupo funcional hidrófilo (14) que facilita la asociación con el material biológico.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el mezclado de las moléculas anfipáticas (10) con la resina plástica polímera comprende además el mezclado de las moléculas anfipáticas (10) en una concentración, con relación a la resina polímera plástica, substancial-mente similar a la concentración que facilita la asociación con el material biológico.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el mezclado de las moléculas anfipáticas (10) con la resina plástica polímera comprende además el recubrimiento de la resina plástica polímera con las moléculas anfipáticas (10).

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el mezclado de las moléculas anfipáticas (10) con la resina plástica polímera comprende la formación de un compuesto de la resina plástica polímera con las moléculas anfipáticas (10).

20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, que comprende además el tratamiento de una superficie del aparato de cultivo de células con descarga corona

o descarga de plasma.

21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, que comprende además el recubrimiento de una superficie del aparato de cultivo de células con poli-D-lisina o colágeno.