PROTEINAS FLUORESCENTES PROCEDENTES DE ESPECIES DE COPEPODOS Y PROCEDIMIENTOS PARA USARLAS.

Molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente,

seleccionada del grupo que consta de:(a) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en los números de secuencia: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18, 20, 22, 24, 26 ó 28;(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida mostrada en los números de secuencia: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ó 27;(c) un ácido nucleico que se hibrida, bajo condiciones severas, al ácido nucleico de (a) o (b), descrito anteriormente;(d) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácido de (a), descrita anteriormente;(e) un ácido nucleico que tiene al menos un 55% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia nucleótida de (b), descrita anteriormente;(f) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una sustitución, supresión o inserción de al menos un aminoácidoen la secuencia de aminoácido mostrada en los números de secuencia: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ó 28;(g) un derivado o mimético del ácido nucleico de (a), (b), (c), (d), (e) o (f), descrito anteriormente;(h) un mutante del ácido nucleico de (a), (b), (c), (d) o (e), descrito anteriormente;(i) un ácido nucleico diferente del ácido nucleico de (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h), descrito anteriormente, debido a la degeneración del código genético; y(j) un fragmento del ácido nucleico de (a) o (b), descrito anteriormente

Campo de la invención

Esta invención se refiere generalmente al campo de biología y química. Más particularmente, la invención está dirigida a proteínas fluorescentes.

Antecedentes de la invención

El marcaje de una proteína, célula u organismo de interés juega un papel prominente en muchas aplicaciones bioquímicas, de biología molecular y de diagnóstico médico. En la materia se ha desarrollado y usado una variedad de diferentes marcajes, incluyendo radiomarcajes, cromomarcajes, marcajes fluorescentes, marcajes quimioluminiscentes y similares, con propiedades variables y usos óptimos. Sin embargo, hay un continuo interés en el desarrollo de nuevos marcajes. Es de particular interés el desarrollo de nuevos marcajes de proteínas, incluyendo proteínas fluorescentes. Las proteínas fluorescentes o fluoroproteínas son proteínas que muestran una fluorescencia baja, media o intensa tras su irradiación con luz con la apropiada longitud de onda de excitación. La característica fluorescente de estas proteínas es aquella que surge de la interacción de dos o más restos de aminoácidos de la proteína, y no de un único resto de aminoácido. Como tales, las proteínas fluorescentes no incluyen las proteínas que sólo muestran fluorescencia en los restos que actúan por sí mismos como fluoróforos intrínsecos, es decir, triptófano, tirosina y fenilalanina. Según se usa en este documento, el término "proteína fluorescente" no incluye las luciferasas, tales como la luciferasa Renilla.

La proteína fluorescente verde (Green Fluorescent Protein, GFP), sus mutantes y homólogos, son ampliamente conocidos hoy en día debido a su intenso uso como marcadores

fluorescentes in vivo en ciencias biomédicas, discutidos en detalle por Lippincott-Schwartz y Patterson en Science (2003) 300 (5616): 87-91). La GFP de la hidromedusa Aequorea aequorea (sinónimo A. victoria), descubierta por Johnson y col. en J Cell Comp Physiol. (1962), 60: 85-104, se encontró formando parte del sistema bioluminiscente de la medusa, en el que la GFP jugaba el papel de un emisor secundario que transformaba la luz azul de la fotoproteína aequorina en luz verde. El ADNc que codifica la GFP de A. victoria fue clonado por Prasher y col. (Gene (1992), 111 (2): 229-33). Resultó que este gen podía expresarse heterológicamente en prácticamente cualquier organismo debido a la habilidad única de la GFP de formar un fluoróforo por sí misma (Chalfie y col., Science 263 (1994), 802-805). Este hallazgo abre amplias perspectivas para el uso de la GFP en biología celular como un marcador fluorescente codificado genéticamente.

La GFP se aplicó en un amplio ámbito de aplicaciones, que incluyen el estudio de la expresión génica y la localización de proteínas (Chalfie y col., Science 263 (1994), 802-805, y Heim y col. en Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504), como una herramienta para visualizar orgánulos subcelulares en células (Rizzuto y col., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), para la visualización del transporte proteico a lo largo de la vía secretora (Kaether y Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).

Se está realizando una abundante investigación para mejorar las propiedades de la GFP y para producir reactivos de GFP útiles y optimizados para una variedad de propósitos de investigación. Se han desarrollado nuevas versiones de la GFP, tales como un ADN de GFP "humanizada", cuyo producto proteico ha aumentado su síntesis en células de mamíferos (Haas, y col., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, y col., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Una de dichas proteínas humanizadas es la "proteína fluorescente verde mejorada (enhanced green fluorescent protein, EGFP) variante mutante de la GFP con dos sustituciones de

aminoácidos: F64L y S65T (Heim y col., Nature 373 (1995), 663-664). Otras mutaciones de la GFP han dado como resultado versiones que emiten luz azul, cian y amarillo-verdosa.

Sin embargo, y a pesar de la gran utilidad de la GFP, otras proteínas fluorescentes con propiedades similares o diferentes a las de la GFP podrían ser útiles en la técnica. En particular, los beneficios de las nuevas proteínas fluorescentes incluyen posibilidades de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (fluorescence resonance energy transfer, FRET) basadas en nuevos espectros y una mejor idoneidad para excitaciones mayores. En 1999 se clonaron homólogos de la GFP a partir de especies de Anthozoa no bioluminescentes (Matz y col., Nature Biotechnol. (1999),

17: 969-973). Este descubrimiento demostró que estas proteínas no son componentes necesarios de la maquinaria de bioluminescencia. Las proteínas similares a la GFP derivadas de Anthozoa mostraron una gran diversidad espectral, incluyendo proteínas fluorescentes cian, verdes, amarillas, rojas y cromoproteínas (CP) no fluorescentes azul púrpura (Matz y col., Bioessays (2002), 24 (10): 953-959). Posteriormente se clonaron ADNc de homólogos de la GFP a partir de diversas medusas hidroides, incluyendo Aequorea macrodactyla (números de acceso de GenBank AF435427-AF435433) y Aequorea coerulescens (Gurskaya y col., Biochem J. (2003), 373 (Pt 2): 403-408). Hasta ahora, los 40 años de historia de investigación de la GFP revelaron proteínas similares a la GFP únicamente en dos clases de Cnidaria, Hydrozoa y Anthozoa.

La utilidad de las proteínas fluorescentes como herramientas en biología molecular ha impulsado la investigación de otras proteínas fluorescentes con propiedades diferentes y mejoradas, en comparación con las proteínas fluorescentes conocidas. Así, es un objeto proporcionar nuevas proteínas fluorescentes que muestren propiedades no disponibles actualmente en el limitado número de proteínas fluorescentes conocidas, así como los ADN que codifican para ellas, que no presenten los inconvenientes de

la conocida GFP.

La técnica anterior relevante incluye el documento WO01/62919 y el depósito de secuencia: genoteca de ADNc BFLG1_000692 Amphioxus 5-6 hrs (convención de nombre: BFLG o MPMGp498) clon de ADNc de Branchiostoma floridae MPMGp498P1084 5-, secuencia de ARNm gi30914228gbBI379061.1[30914228].

Resumen de la invención

Según la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado, que codifica una proteína fluorescente, elegida del grupo formado por:

(a) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos según se muestra en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26 ó 28;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ó 27;

(c) un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con el ácido nucleico de (a) o (b) anteriores, en el que dichas condiciones rigurosas son al menos tan rigurosas como una hibridación a 42°C en una disolución que comprende formamida al 50%, 5 x SSC, fosfato sódico 50 mM, 5 x disolución de Denhardt y sulfato de dextrano al 10%, seguido de un lavado de los filtros con 0,1 veces SSC a aproximadamente 65°C;

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene al menos una identidad de secuencia del 65% con la secuencia de aminoácidos de (a) anterior;

(e) un ácido nucleico que tiene al menos una identidad de secuencia del 75% con la secuencia de nucleótidos de (b) anterior; y

(f) un ácido nucleico que difiere del ácido nucleico de (b) anterior debido a la degeneración del código genético. Preferiblemente, dicho ácido nucleico se aísla a partir

de un organismo de un filo Arthropoda. Preferiblemente, dicho ácido nucleico se aísla a partir

de un organismo de una subclase Copepoda.

Preferiblemente, dicho ácido nucleico se aísla a partir de una familia Pontellidae.

En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de la presente invención se aísla a partir de copépodos (filo Arthropoda; subfilo Crustacea; clase Maxillopoda; subclase Copepoda) o mutantes o derivados de los mismos.

También se proporciona según la presente invención un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.

También se proporciona según la presente invención un casete de expresión que comprende (a) la molécula de ácido nucleico según la presente invención; y (b) elementos reguladores para la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en la célula hospedadora deseada.

1. Una molécula de ácido nucleico aislado, que codifica una proteína fluorescente, elegida del grupo formado por:

(a) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos según se muestra en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26 ó 28;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ó 27;

(c) un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con el ácido nucleico de (a) o (b) anteriores, en el que dichas condiciones rigurosas son al menos tan rigurosas como una hibridación a 42°C en una disolución que comprende formamida al 50%, 5 x SSC, fosfato sódico 50 mM, 5 x disolución de Denhardt y sulfato de dextrano al 10%, seguido de un lavado de los filtros con 0,1 veces SSC a aproximadamente 65°C;

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene al menos una identidad de secuencia del 65% con la secuencia de aminoácidos de (a) anterior;

(e) un ácido nucleico que tiene al menos una identidad de secuencia del 75% con la secuencia de nucleótidos de (b) anterior; y

(f) un ácido nucleico que difiere del ácido nucleico de (b) anterior debido a la degeneración del código genético.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico se aísla a partir de un organismo de un filo Arthropoda.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico se aísla a partir de un organismo de una subclase Copepoda.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico se aísla a partir de una

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.

6. Un casete de expresión que comprende (a) la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1; y (b) elementos reguladores para la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en la célula hospedadora deseada.

7. Una célula que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, el vector según la reivindicación 5 o el casete de expresión según la reivindicación 6.

8. Una línea celular estable que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, el vector según la reivindicación 5 o el casete de expresión según la reivindicación 6.

9. Una planta transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, el vector según la reivindicación 5 o el casete de expresión según la reivindicación 6.

10. Un animal transgénico no humano que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, el vector según la reivindicación 5 o el casete de expresión según la reivindicación 6.

11. Un procedimiento para producir una proteína fluorescente, comprendiendo dicho procedimiento (a) proporcionar una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 unida operativamente a elementos reguladores de la expresión adecuados (b) expresar la proteína fluorescente a partir de dicha molécula de ácido nucleico, y

familia Pontellidae.

(c) aislar la proteína sustancialmente libre de otras proteínas.

12. Una proteína fluorescente aislada elegida del grupo formado por:

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos según se muestra en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ó 28;

(b) una proteína codificada por la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ó 27; y

(c) una proteína que tiene al menos una identidad de secuencia del 65% con la secuencia de aminoácidos de (a) o

(b) anteriores;

13. Una proteína de fusión que comprende la proteína según la reivindicación 12.

14. Un anticuerpo que se une específicamente a la proteína según la reivindicación 12 (a).

15. Un kit que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1, el vector según la reivindicación 5, el casete de expresión según la reivindicación 6, la proteína según la reivindicación 12, la proteína de fusión según la reivindicación 13 o un medio para producir los mismos.

16. Una sonda de oligonucleótidos o un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos capaz de hibridar en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos elegida del grupo formado por las SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, en la que dichas condiciones rigurosas son al menos tan rigurosas como una hibridación a 42°C en una disolución que comprende formamida al 50%, 5 x SSC, fosfato sódico 50 mM, 5 x disolución de Denhardt y sulfato de dextrano al 10%, seguido de un lavado de los filtros con 0,1 veces SSC a aproximadamente 65°C.