Proteína de fusión en la que un péptido carboxilo terminal (CTP) de la trombopoyetina (TPO) que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

2 se fusiona con eritropoyetina humana (EPO) en el extremo carboxilo terminal de la EPO humana

Proteína de fusión que tiene actividad in vivo de eritropoyetina mejorada.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una proteína de fusión que tiene actividad in vivo de eritropoyetina (EPO, a continuación) mejorada que es un nuevo medicamento para el tratamiento de la anemia. Específicamente, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que tiene semivida y actividad in vivo de eritropoyetina sumamente mejoradas mediante la fusión de una molécula de EPO con un determinado péptido que tiene actividad de prolongación de la semivida y se deriva del cuerpo humano.

Antecedentes de la técnica

La EPO, una glicoproteína que tiene el peso molecular de 30.000 a 34.000, es un factor que estimula la producción y la diferenciación de los glóbulos rojos. Esta proteína actúa uniéndose a receptores en las células precursoras de eritrocitos dando como resultado un aumento de la concentración de iones calcio en una célula, un aumento de la biosíntesis de ADN y la estimulación para la formación de hemoglobina y similares. Esta EPO puede usarse para el tratamiento de anemia debida a insuficiencia renal, anemia de un bebé prematuro, anemia debida a hipotiroidismo, anemia debida a desnutrición, etc. El uso clínico de la EPO humana recombinante sigue en aumento. Sin embargo, tal uso puede provocar cierta incomodidad y altos costes puesto que debe administrarse en promedio tres veces a la semana debido a su corta semivida. Por tanto, si se mantiene la actividad in vivo de la EPO durante un largo tiempo, puede disminuirse enormemente la frecuencia de administración de la EPO.

La eficacia de la EPO es proporcional a la semivida in vivo de la misma. Se conoce que la semivida in vivo de la EPO está correlacionada con el contenido en ácido siálico que está ubicado en el extremo terminal de las cadenas de hidrato de carbono de la EPO. Por tanto, la eficacia de la EPO es depende mucho de la presencia de las cadenas de hidrato de carbono. Dado que las formas de los hidratos de carbono aparecen de manera diferente dependiendo del tipo de células en las que se expresa la EPO, las mismas glicoproteínas pueden tener una estructura de hidrato de carbono diferente si se expresan en células diferentes. Aunque se ha demostrado recientemente que algunas bacterias pueden unirse a las cadenas de hidrato de carbono, se conoce que no lo hacen bacterias típicas, por ejemplo E. coli. Las proteínas expresadas en E. coli no contienen las cadenas de hidrato de carbono, y por tanto, la EPO derivada de E. coli, que no contiene las cadenas de hidrato de carbono, muestra actividad in vitro positiva pero no actividad in vivo. Esto se debe a que la EPO desglicosilada se elimina rápidamente del cuerpo humano y tiene una semivida extremadamente corta. En conclusión, las cadenas de hidrato de carbono desempeñan un papel muy importante en la actividad de la EPO.

Se han realizado muchos estudios para mejorar la actividad de la EPO. El principal enfoque son las sustituciones de algunos aminoácidos de la EPO mediante mutagénesis en el gen de la EPO. Por ejemplo, el documento PCT/US94/09257, presentado por Amgen y titulado "Erythropoietin analogs", da a conocer un método para aumentar la semivida in vivo de la EPO aumentando el contenido en hidratos de carbono a través de mutagénesis. También, se realizó un intento para aumentar la semivida in vivo de la EPO mediante la formación de un dímero de EPO. Véase, A. J. Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, n.º 35, págs. 24773-24778. Además, otro método conocido es mejorar la actividad in vivo de la EPO fusionando nuevos aminoácidos, péptidos o fragmentos de proteína con la molécula de EPO del modo mediante ingeniería genética y aumentando el contenido en hidratos de carbono, es decir, el contenido en ácido siálico de la EPO. Sin embargo, no pueden usarse todos los aminoácidos, péptidos o fragmentos de proteína heterogéneos para este fin. En la mayoría de los casos, tales modificaciones pueden dar como resultado una disminución o pérdida de la actividad inherente de la proteína y pueden provocar un problema de antigenicidad cuando se usan in vivo.

Aunque no está relacionado con la EPO, se han estudiado proteínas de fusión o proteínas quiméricas, por ejemplo, para la hormona estimulante del folículo que es un tipo de hormona sexual. Véase, Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocrinol. Sin embargo, los métodos no se han aplicado a la industria dado que las modificaciones de proteínas usando un método de ingeniería genética tienen muchos riesgos. Es decir, en la mayoría de los casos, la proteína diana no puede obtenerse fácilmente sin conocimientos profesionales, y al contrario, la actividad inherente de la proteína puede disminuirse o perderse mediante la adición o la sustitución de nuevos aminoácidos.

Descripción de la invención

Los presentes inventores han estudiado extensamente nuevos métodos para mejorar la actividad in vivo de la EPO fusionando nuevos aminoácidos, péptidos o fragmentos de proteína con una molécula de EPO, y aumentando así el contenido en hidratos de carbono de la misma. Como resultado, los presentes inventores han descubierto que una proteína de fusión de la EPO obtenida fusionando un péptido carboxilo terminal (CTP, a continuación) de la trombopoyetina (TPO, a continuación), una proteína que ya existe en el cuerpo humano, con el extremo carboxilo terminal de la EPO tiene una semivida in vivo sumamente mejorada debido a muchos aminoácidos que aumentan el sitio de glicosilación sin pérdida de la actividad inherente de la EPO, y no provoca antigenicidad cuando se aplica al cuerpo humano. Entonces, los presentes inventores han completado la presente invención.

Por tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar una proteína de fusión que tiene actividad in vivo de EPO humana mejorada y que contiene el CTP de TPO fusionado con EPO humana en el extremo carboxilo terminal de la misma.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión, un vector recombinante que contiene el ácido nucleico, y una línea celular huésped transformada con el vector recombinante.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la preparación de la proteína de fusión que tiene actividad in vivo de EPO humana mejorada cultivando la línea celular transformada.

En primer lugar, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que tiene actividad in vivo de EPO humana mejorada y que contiene el CTP de TPO fusionado con EPO humana en el extremo carboxilo terminal de la misma, consistiendo el CTP en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.º 2 que corresponde a los aminoácidos de las posiciones 337 a 353 (STP, a continuación).

Particularmente, la proteína de fusión según la presente invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.º 4.

En segundo lugar, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión, a un vector recombinante que contiene el ácido nucleico y a una línea celular huésped, preferiblemente célula CHO (ovario de hámster chino), transformada con el vector recombinante.

En tercer lugar, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de la proteína de fusión que tiene actividad in vivo de EPO humana mejorada cultivando la línea celular transformada.

Se incluye en el presente documento como referencia un CTP que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.º 1 que corresponde a los aminoácidos de las posiciones 176 a 353 (LTP, a continuación) o partes de la misma, y no es parte de la presente invención.

A continuación, la presente invención se explicará con más detalle.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1a y 1b muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los péptidos carboxilo terminal (LTP, STP) de TPO;

Las figuras 2aa y 2ab muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ELTP que es una proteína de fusión de EPO y el péptido LTP, y la figura 2b muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ESTP que es una proteína de fusión de EPO y el péptido STP;

Las figuras 3a y 3b son esquemas que muestran los procedimientos para preparar los vectores de expresión, pcDNA-ELTP y pcDNA-ESTP;

La figura 4...

1. Proteína de fusión en la que un péptido carboxilo terminal (CTP) de la trombopoyetina (TPO) que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 se fusiona con eritropoyetina humana (EPO) en el extremo carboxilo terminal de la EPO humana.

2. Ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión según la reivindicación 1.

3. Procedimiento para la preparación de una proteína de fusión que tiene actividad in vivo de EPO humana mejorada que comprende el cultivo de una línea celular huésped transformada con un vector recombinante que contiene el ácido nucleico según la reivindicación 2.