PROCESOS PARA LOGRAR UNA RESISTENCIA A PATOGENOS EN VEGETALES.

Método para lograr o aumentar la resistencia contra al menos patógeno fúngico o patógeno similar a un hongo en plantas monocotiledóneas de cultivo,

caracterizado porque están comprendidos los siguientes pasos de trabajo

a) Disminución de la cantidad de proteína, actividad o función de una oxidasa NADPH en una planta o un tejido, órgano, parte o célula de la misma y

b) selección de las plantas en las que, a diferencia de o en comparación con la planta de partida, existe la resistencia frente a al menos un patógeno o se aumenta, y la oxidasa NADPH se codifica mediante

a) Secuencias de polipéptidos que comprenden una secuencia según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22, o

b) Secuencias de polipéptidos de un equivalente funcional de un polipéptido el cual comprende una secuencia según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22

Procesos para lograr una resistencia a patógenos en vegetales.

La invención se refiere a la generación o al incremento de una resistencia frente a un patógeno fúngico o a un patógeno similar a un hongo en plantas monocotiledoneas mediante la disminución de la expresión, actividad o función de una oxidasa NADPH.

Es meta de trabajos biotecnológicos en vegetales la producción de plantas con propiedades novedosas, ventajosas, por ejemplo para el aumento de la productividad agrícola. Con frecuencia, los mecanismos naturales de defensa de la planta son insuficientes frente a los patógenos. Solas las enfermedades por hongos conducen a pérdidas en las cosechas en una cuantía de muchos millardos de dólares estadounidenses al año. La introducción de genes ajenos de vegetales, animales o fuentes microbianas puede fortalecer las defensas. Son ejemplos la protección frente a ser devorados por insectos mediante la expresión de endotoxinas de Bacillus thuringiensis (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) o la protección frente a la infestación de hongos mediante expresión de una quitinasa de frijol. (Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197). Sin embargo, la mayoría de los planteamientos descritos garantizan solo una resistencia frente a un patógeno individual o frente a un espectro estrecho de patógenos.

Hay solo unos pocos planteamientos que confieren una resistencia a las plantas una resistencia frente a un espectro amplio de patógenos. La resistencia sistémica adquirida ("systemic acquired resistance"; SAR), que es un mecanismo de defensa en las diversas interacciones entre planta/patógeno, puede suministrarse mediante aplicación de sustancias mensajeras endógenas como el ácido jasmónico (JA) o el ácido salicílico (SA) (Ward et al. (1991) Plant Cell 3:1085-1094; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4 (6): 645-656). También pueden producirse efectos similares por compuestos sintéticos como el ácido 2,6-diclorisonicotínico (INA) o el éster S-metílico del ácido benceno(1,2,3)tiadiazol-7-tiocarboxílico (BTH; Bionr) (Friedrich et al. (1996) Plant J 10(1):61-70; Lawton et al. (1996) Plant J 10:71-82). La expresión de una proteína altamente regulada "pathogenesis related" (PR) (relacionada con la patogénesis), en el contexto de un SAR, también está en capacidad de producir en parte una resistencia al patógeno.

En cebada se ha descrito el locus Mlo como regulador negativo de la defensa ante patógeno. La pérdida del gen Mlo implica una resistencia elevada y no específica por raza frente a las numerosas especies de mildiú (Büschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; Jorgensen JH (1977) Euphytica 26:55-62; Lyngkjaer MF et al. (1995). Probablemente debido a la recesividad, a pesar de un proceso de cultivo intenso, la resistencia ha demostrado ser duradera. No se han descrito resistencias similares a Mlo en otros vegetales, ante todo en variedades de cereales. El gen Mlo y diversos homólogos de otras variedades de cereal se han identificado y clonado (Büschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; WO 98/04586; Schulze-Lefert P, Vogel J (2000) Trends Plant Sci. 5:343-348). Se han descrito diversos métodos usando estos genes para lograr una resistencia ante el patógeno (WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552). Es desventajoso que el mecanismo de defensa porporcionado por Mlo abarque una muerte espontánea de las células en las hojas (Wolter M et al. (1993) Mol Gen Genet 239:122-128). También es desventajoso que los genotipos deficientes de Mlo muestren una hipersusceptibilidad frente a patógenos hemibiotróficos, tales como Magnaporte grisea (M. grisea) así como Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana) (Jarosch B et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Kumar J et al. (2001) Phytopathology 91:127-133).

A la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS; por ejemplo, superóxido (O^2-), radicales hidroxilo y H₂O₂) se asigna una función protectora importante en la reacción sobre patógenos vegetales (Wojtaszek P (1997) Biochem J 322: 681-692). Se conocen diversas rutas de cómo una célula es capaz de producir ROS. En los macrófagos de mamíferos debe nombrarse aquí en especial la oxidasa de NADPH la cual es capaz de transferir electrones al oxígeno molecular. Las enzimas homólogas también se han identificado en vegetales (Lamb & Dixon (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:251).

Se ha mostrado que las mutaciones en la sub-unidad catalítica de la oxidasa NADPH en Arabidopsis thaliana muestran una acumulación reducida de los intermediarios reactivos de oxígeno (ROI, por sus siglas en inglés). Con respecto a la reacción hipersensible (HR) el cuadro no era uniforme: en un mutante doble se encontró una HR reducida al infectarse con la bacteria avirulenta Pseudomonas syringae mientras que con el oomycetes virulento Peronospora parasitica se detectó una HR elevada. El crecimiento, de las cepas de P. Syringae, tanto virulentas como también avirulentas, fue no obstante invariable en comparación con las plantas del tipo silvestre. (Torres MA et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99: 517-522). Así mismo, la inhibición de la oxidasa NADPH por medio del inhibidor cloruro de difenilenyodonio (DPI) - al emplear concentraciones fisiológicamente relevantes, no tuvo efecto en el desarrollo de hongos patógenos (Hückelhoven R & Kogel KH (1998) Mol Plant Microbe Interact 11;292-300). Se ha descrito un fragmento de cADN de una oxidasa NADPH fagocítica de cebada (pNAox, homólogo de la subunidad grande gp91phox de una oxidasa NADPH fagocitíca) bajo el número de cuenta del banco genético Gen-Bank Acc.-No.: AJ251717.

La tarea en la que se fundamenta la invención es suministrar nuevos procesos para la defensa frente a patógenos en vegetales, que generen una defensa eficiente de un espectro lo más amplio posible de patógenos en la mayor cantidad de variedades posibles, preferiblemente en las plantas de cultivo usadas en la agricultura. Esta tarea se resuelve mediante el proceso de acuerdo con la invención.

Un primer objeto de la invención comprende un proceso para la generación o incremento de la resistencia frente a al menos un hongo patógeno o un patógeno similar a un hongo en plantas monocotiledóneas, caracterizado porque comprende los siguientes pasos de trabajo

De manera sorprendente, la disminución de la expresión de una oxidasa NADPH de cebada (pNAox) en la célula epidérmica mediante un planteamiento de interferencia de ARN específica usando pNAox-dsARN ("Gene-Silencing") bicatenario muestra una infestación significativamente reducida a consecuencia de una infección Bgh (medida por medio de la formación de haustorio). Este hallazgo es particularmente sorprendente puesto que a la liberación de especies reactivas de oxígeno ("oxidative burst"), que se asocia con oxidasa NADPH, generalmente se atribuye una función protectora.

De manera similar al Mlo, la disminución de la expresión de oxidasa NADPH proporciona una amplia resistencia a diversos aislados de Blumeria graminis f.sp. hordei. En experimentos de "gene-silencing" transitorio la eficiencia de penetración (formación de haustorios) de Bgh se reduce significativamente en más de 35%, un efecto que, en su intensidad, corresponde al efecto obtenido por medio de Mlo-dsARN (Schweizer P et al. (2000) Plant J 24:895-903). En variedades de cebada Pallas del tipo silvestre, aproximadamente 40% de la penetración del hongo da lugar a una formación de haustorios, mientras que la rata de penetración en el caso de una disminución de la expresión de oxidasa de NADPH mediante introducción de un ARN bicatenario de la oxidasa NADPH (pNAox-dsARN) solo alcanza aproximadamente 25%. El hecho de que incluso en variedades de tipo silvestre, sensibles a patógenos, como pallas solo puede observarse una penetración de aproximadamente 40 a 50%, puede atribuirse a la resistencia basal que siempre está presente. Debido a este hallazgo, la oxidasa NADPH debe entenderse como el elemento clave para la penetración exitosa de un patógeno como Bgh en la célula vegetal. Además, el método es superior a todos aquellos métodos donde se genera un...

1. Método para lograr o aumentar la resistencia contra al menos patógeno fúngico o patógeno similar a un hongo en plantas monocotiledóneas de cultivo, caracterizado porque están comprendidos los siguientes pasos de trabajo

2. Método según la reivindicación 1, en el que el equivalente funcional tiene una homología de al menos 50% con uno de los polipéptidos según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22.

3. Método según una de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que se garantiza la disminución de la cantidad de proteína, actividad o función de una oxidasa NADPH mediante la aplicación de un método seleccionado del grupo compuesto de

4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende

5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el patógeno es mildiú.

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual la planta se selecciona del grupo de las plantas monocotiledóneas que se compone de trigo, avena, mijo, cebada, centeno, maíz, arroz, sorgo, triticale, espelta y caña de azúcar.

7. Molécula de ARN bicatenario para la disminución de la expresión de una oxidasa NADPH que comprende

y

y una de las dos cadenas de ARN se codifica mediante al menos una parte de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una secuencia de oxidasa NADPH según SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ó 21 o un equivalente funcional de la misma.

8. Molécula de ARN bicatenario según la reivindicación 7, en la que ambas cadenas de ARN del ARN bicatenario están enlazadas una con otra de manera covalente.

9. Casetes transgénicos de expresión que, en conexión funcional con promotor que es funcional en un organismo vegetal, contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una molécula de ARN bicatenario según una de las reivindicaciones 7 ó 8.

10. Casete transgénico de expresión que contiene al menos una parte de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una oxidasa NADPH según SEQ ID NO: l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ó 21 o un equivalente funcional de la misma, y dicha secuencia de ácidos nucleicos está conectada funcionalmente en orientación antisense con un promotor funcional en organismos vegetales.

11. Casete transgénico de expresión según la reivindicación 9 ó 10 en el cual el promotor funcional en las plantas es un promotor inducible por patógeno.

12. Vector transgénico que contiene un casete de expresión según una de las reivindicaciones 9 a 11.

13. Organismo transgénico que contiene una molécula de ARN bicatenario según una de las reivindicaciones 7 a 8, un casete de expresión según una de las reivindicaciones 9 a 11 o un vector según la reivindicación 12, seleccionado del grupo que se compone de bacterias, levaduras y plantas monocotiledoneas de cultivo.

14. Organismo transgénico según la reivindicación 13 seleccionado del grupo de plantas compuesto de trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, maíz, arroz, sorgo, avena y caña de azúcar.

15. Tejido, órgano, parte, célula, cultivo celular o material de reproducción derivado de un organismo transgénico según una de las reivindicaciones 13 ó 14 y que contiene un casete de expresión según una de las reivindicaciones 9 a 11 o que contiene una molécula de ARN bicatenario según una de las reivindicaciones 7 a 8.