PROCEDIMIENTOS Y KITS PARA MEDIR COMPLEJOS ADAMTS13/FXI.
Un procedimiento para detectar complejos ADAMTS 13/FXI en una muestra que comprende:
a) unir un anticuerpo anti-ADAMTS 13 a una fase sólida;
b) añadir la muestra a la fase sólida, uniéndose los complejos ADAMTS13/FXI presentes en la muestra al anticuerpo;
c) añadir un anticuerpo anti-FXI a la fase sólida, uniéndose el anticuerpo anti-FXI a FXI en complejos ADAMTS 13/FXI; y
d) detectar complejos ADAMTS 13/FXI mediante inmunomarcaje directo o indirecto del anticuerpo anti-FXI
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W05012964US.
Solicitante: AMERICAN DIAGNOSTICA INC.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 500 WEST AVENUE P.O. BOX 110215,STAMFORD, CT 06911-0215.
Inventor/es: GREENFIELD, ROBERT S., GUINTO,ENRIQUETA, RANZURMAL,SAFI, GRAFOS,NICHOLAS.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 2 de Septiembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/37 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › peptidasa o proteinasa.
Clasificación PCT:
- C12Q1/37 C12Q 1/00 […] › peptidasa o proteinasa.
- C12Q1/56 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen factores de coagulación de la sangre, p. ej. trombina, tromboplastina, fibrinógeno.
- G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
- G01N33/536 G01N 33/00 […] › con formación de un complejo inmunológico en fase líquida.
Fragmento de la descripción:
Procedimientos y kits para medir complejos ADAMTS13/FXI.
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud hace referencia a la solicitud internacional número PCT/US2004/023177, presentada el 19 de julio de 2004.
Campo de la invención
La invención proporciona ensayos para la medición de la actividad de ADAMTS13 y el diagnóstico de la púrpura trombocitopénica trombótica.
Antecedentes de la invención
La púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) es una enfermedad microangiopática trombótica potencialmente mortal caracterizada por anemia hemolítica y trombocitopenia asociada con agregación plaquetaria. La causa de la PTT se ha vinculado recientemente a anomalías en una metaloproteinasa denominada ADAMTS13 o proteasa de rotura del factor de von Willebrand. ADAMTS 13 es una enzima que está presente en niveles significativos en el plasma, y puede expresarse en otros tejidos (Levy et al. 2001, Nature 413:488-494; Plaimauer et al. 2002, Blood 100:3626-3632). Suzuki et al. (2004, Biochem. Biophys. Res. Com. 313:212-216) notificaron recientemente ADAMTS 13 en plaquetas.
ADAMTS13 actúa rompiendo multímeros de factor de von Willebrand (VWF) ultralargos en proteínas de VWF más pequeñas. Una disminución de la actividad proteasa de rotura de VWF conduce a la persistencia de multímeros inusualmente largos de VWF que se unen a plaquetas, produciendo agregados plaquetarios, hemólisis microangiopática y trombocitopenia en pacientes con PTT. Las manifestaciones clínicas de la PTT son difíciles de distinguir del síndrome urémico hemolítico (SUH), otro trastorno microangiopático trombótico. Estudios recientes indican que niveles bajos de actividad de ADAMTS 13 están asociados con la PTT, pero no con SUH (Veyradier A, et al. 2002, Blood 98:1765-1772; Furlan et al. 1998, Blood 91:2839-2846). Por tanto, puede realizarse un diagnóstico diferencial de la PTT midiendo la actividad de ADAMTS 13.
Hay dos formas de PTT - congénita (familiar) y adquirida (Furlan et al. 1996, Blood 87:4223-4234; Furlan et al. 1998, Blood 91:2839-2846). La PTT congénita está provocada por mutaciones genéticas en el gen de ADAMTS13, que dan como resultado una pérdida en la producción de ADAMTS13 y/o la producción de una enzima ADAMTS 13 no funcional. La PTT adquirida es una enfermedad de tipo autoinmunitario, que se ha vinculado con la ingesta de ciertos fármacos farmacéuticos. La PTT adquirida está provocada por la generación de autoanticuerpos frente a la proteína ADAMTS 13. La aparición de la PTT adquirida se ha vinculado con la ingesta de ciertos fármacos farmacéuticos.
Se conocen en la técnica varios procedimientos para medir la presencia y/o actividad de ADAMTS 13. Estos procedimientos incluyen ensayos de unión a colágeno, ensayos de cofactor ristocetina, análisis electroforético (por ejemplo, análisis de multímeros) y procedimientos inmunológicos. Los inmunoensayos electroforéticos, tales como el análisis de inmunotransferencia de tipo Western, se han sustituido en buena parte por ensayos inmunorradiométricos (IRMA) y ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) (Laffan et al. 2004, Haemophilia 10:199-217). Varios informes describen ensayos de ADAMTS 13 en los que se usa el dominio A2 de VWF como sustrato (Zhou et al. 2004, Thromb. Haemost. 91:806-811; Kokame et al. 2004, Hemost. Thromb. Vasc. Biol. Blood 103:607-612; Cruz et al. 2004, Thromb. Haemost. 90:1204-1209). Se controla la rotura del dominio A2 mediante un procedimiento de ELISA. Los ensayos disponibles para ADAMTS 13 requieren un nivel de destreza técnica relativamente alto, y por tanto no se realizan en la mayoría de los laboratorios clínicos. Además, la obtención de los resultados puede llevar varios días usando las pruebas disponibles, lo que es perjudicial para pacientes que presentan PTT, que requieren un rápido diagnóstico.
Se necesita un ensayo para ADAMTS 13 sencillo, específico y rápido para resolver los problemas de los ensayos actualmente disponibles; sin embargo, no se ha desarrollado ninguno hasta la fecha. Los intentos de desarrollar un ensayo de este tipo usando ADAMTS 13 aislado a partir de plasma no han sido satisfactorios. Furlan et al. sometieron a prueba 28 sustratos peptidílicos cromogénicos sintéticos con para-nitroanilina (pNA) como grupo saliente, y no observaron resultados constantes, repetibles (2002 Seminars in Thrombosis and Hemostasis 23(2): 167-172). Estos resultados demuestran la dificultad en la técnica de desarrollar un ensayo rápido, fiable para determinar la actividad de ADAMTS 13.
Se ha descubierto que ADAMTS 13 en plaquetas tiene una capacidad potenciada, en relación con ADAMTS13 en plasma, para romper sustratos peptidílicos pequeños. La diferencia entre ADAMTS13 plasmática y plaquetaria se debe probablemente al hallazgo de que ADAMTS 13 plaquetaria se rompe, mientras que ADAMTS13 plasmática no se rompe y permanece como un único polipéptido. La actividad de ADAMTS 13 en plaquetas puede potenciarse mediante tratamiento con el factor de coagulación XI activado (FXIa). Esto indica que FXIa puede provocar la rotura de ADAMTS 13. Se han desarrollado ensayos cromogénicos de diagnóstico para medir la actividad de ADAMTS 13 en plaquetas y en plasma usando diferentes sustratos peptidílicos con grupos salientes distintos de pNA. Se ha desarrollado también un procedimiento de ensayo para medir autoanticuerpos frente a ADAMTS13 y un ELISA para medir la proteína ADAMTS13 en plasma. Además, se ha desarrollado un ELISA para medir complejos ADAMTS13/FXI en plasma.
Sumario de la invención
En un aspecto, la solicitud describe un procedimiento para medir la actividad de ADAMTS13 que comprende (a) incubar una muestra que comprende ADAMTS13 con un sustrato, en el que el sustrato comprende un resto peptídico y un resto fluorogénico o cromogénico, en el que el resto peptídico comprende X-Val-Tyr, X-Leu-Tyr o X-Ile-Tyr, en los que X es cualquier aminoácido, y en el que el resto cromogénico no es para-nitroanilina (pNA); y (b) medir la densidad óptica o fluorescencia de la muestra; midiendo de ese modo la actividad de ADAMTS13.
En un segundo aspecto, la solicitud describe un procedimiento para medir la actividad de ADAMTS 13 que comprende (a) incubar una muestra que comprende ADAMTS13 con un sustrato, en el que el sustrato comprende X-resto peptídico-Z, en el que el resto peptídico comprende Val-Tyr-Met, Leu-Tyr-Met o Ile-Tyr-Met, en el que X es un resto donador y Z es un resto aceptor y en el que los restos donador y aceptor median la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia; y (b) medir la fluorescencia de la muestra; midiendo de ese modo la actividad de ADAMTS13.
También se describe mediante la solicitud una proteína ADAMTS13 aislada a partir de plaquetas, en la que la proteína ADAMTS13 se rompe en más de un péptido y en la que al menos un péptido roto tiene un peso molecular en un gel de SDS-PAGE de aproximadamente 120 kD o inferior a 120 kD.
La solicitud describe también un procedimiento para preparar un sustrato de ADAMTS13 para medir la actividad de ADAMTS13 que comprende unir covalentemente un resto peptídico a un resto cromogénico o fluorogénico, en el que el resto peptídico comprende X-Val-Tyr, X-Leu-Tyr o X-Ile-Tyr, en los que X es cualquier aminoácido, y en el que el sustrato cromogénico no es pNA.
En un quinto aspecto, la solicitud describe un procedimiento para preparar un sustrato de ADAMTS 13 para medir la actividad de ADAMTS 13 que comprende unir covalentemente un resto donador, un resto peptídico y un resto aceptor secuencialmente, en el que el resto peptídico comprende Val-Tyr-Met, Leu-Tyr-Met o Ile-Tyr-Met y en el que los restos donador y aceptor median la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia.
Otra realización de la solicitud, que no forma parte de la invención, es un kit que comprende un sustrato para medir la actividad de ADAMTS13, en el que el sustrato comprende un resto peptídico tal como se describe en el presente documento y un resto cromogénico o fluorogénico. Como alternativa, el sustrato comprende un resto donador, un resto peptídico tal como se describe en el presente documento y un resto aceptor, en el que los restos donador y aceptor median la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia.
En otro aspecto, la solicitud describe un procedimiento para inhibir la actividad de ADAMTS 13 que comprende incubar una muestra que comprende ADAMTS13 con un anticuerpo inhibidor contra ADAMTS13.
En...
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para detectar complejos ADAMTS 13/FXI en una muestra que comprende:
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra se selecciona del grupo constituido por un líquido biológico, sangre completa, suero, plasma, plasma rico en plaquetas (PRP), plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma normal combinado (PNP), plaquetas lavadas y sobrenadante de cultivo tisular.
3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase sólida es una membrana, una placa, un micropocillo o una perla.
4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección de complejos ADAMTS13/FXI es mediante inmunomarcaje directo del anticuerpo anti-FXI.
5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo anti-FXI está marcado con peroxidasa del rábano.
6. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección de complejos ADAMTS13/FXI es mediante inmunomarcaje indirecto del anticuerpo anti-FXI.
7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo anti-FXI se produce en una primera especie y en el que un anticuerpo marcado producido en una segunda especie contra anticuerpos de la primera especie se añade a la fase sólida y se detecta.
8. Un procedimiento para medir la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en una muestra que comprende el procedimiento según la reivindicación 1 y que comprende además:
9. Un procedimiento para diagnosticar púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) en un sujeto que comprende
en el que se diagnostica PTT mediante una cantidad reducida de complejos ADAMTS13/FXI en la muestra de prueba en comparación con la muestra control.
10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que la muestra de prueba se selecciona del grupo constituido por sangre completa, suero, plasma, plasma rico en plaquetas (PRP), plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma normal combinado (PNP) y plaquetas lavadas.
11. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que la fase sólida es una membrana, una placa, un micropocillo o una perla.
12. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que la detección de complejos ADAMTS13/FXI es mediante inmunomarcaje directo del anticuerpo anti-FXI.
13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que el anticuerpo anti-FXI está marcado con peroxidasa del rábano.
14. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que la detección de complejos ADAMTS13/FXI es mediante inmunomarcaje indirecto del anticuerpo anti-FXI.
15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo anti-FXI se produce en una primera especie y en el que un anticuerpo marcado producido en una segunda especie contra anticuerpos de la primera especie se añade a la fase sólida y se detecta.
16. Un kit para detectar complejos ADAMTS 13/FXI en una muestra que comprende:
17. El kit según la reivindicación 16, en el que el anticuerpo anti-FXI está marcado.
18. El kit según la reivindicación 17, en el que el anticuerpo frente a FXI está marcado con peroxidasa del rábano.
19. El kit según la reivindicación 18, que comprende además un sustrato para la peroxidasa del rábano.
20. El kit según la reivindicación 16, que comprende además uno o más componentes seleccionados del grupo constituido por una muestra patrón, un control positivo y un tampón de lavado.
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