PROCEDIMIENTOS PARA IDENTIFICAR PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA FOSFORILANTE DE ALMIDON.
Un procedimiento para identificar una proteína que presenta actividad enzimática fosforilante de alfa-1,
4-glucanos y requiere alfa-1,4-glucanos fosforilados como sustrato en el que
a) se incuban extractos de proteína con alfa-1,4-glucanos fosforilados,
b) se disuelven proteínas específicamente unidas a los alfa-1,4-glucanos fosforilados de la Etapa a),
c) las proteínas obtenidas según la Etapa b) se incuban respectivamente con
iATP y alfa-1,4-glucanos fosforilados y
iiATP y alfa-1,4-glucanos no fosforilados en preparaciones separadas entre sí,
d) se examina el alfa-1,4-glucano respectivo obtenido después de la incubación en la Etapa c) i o la Etapa c) ii para comprobar la introducción de otros grupos fosfato y
e) se identifican proteínas que en la preparación de la incubación según c) i han introducido grupos fosfato en alfa-1,4-glucanos en una cantidad que es al menos dos veces superior a la cantidad determinada en experimentos de control y en la preparación de la incubación según c) ii no han introducido grupos fosfato en alfa-1,4-glucanos en una cantidad que es al menos dos veces superior a la cantidad determinada en experimentos de control
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2005/002454.
Solicitante: BAYER CROPSCIENCE AG.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: ALFRED-NOBEL-STRASSE 50,40789 MONHEIM.
Inventor/es: FROHBERG, CLAUS, KOETTING,OLIVER, RITTE,GERHARD, STEUP,MARTIN.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 19 de Mayo de 2010.
Clasificación PCT:
- A01H5/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- C07K14/415 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
- C12N15/82 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células vegetales.
- C12N5/04 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células o tejidos vegetales.
- C12Q1/48 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una transferasa.
Clasificación antigua:
- A01H5/00 A01H […] › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- C07K14/415 C07K 14/00 […] › de vegetales.
- C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
- C12N5/04 C12N 5/00 […] › Células o tejidos vegetales.
- C12Q1/48 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una transferasa.
Fragmento de la descripción:
Procedimientos para identificar proteínas con actividad enzimática fosforilante de almidón.
La presente invención se refiere a un procedimiento para identificar proteínas que participan en la fosforilación de almidón y a ácidos nucleicos que codifican tales proteínas. La invención se refiere además a células vegetales y plantas que presentan una elevada actividad de una proteína identificable usando el procedimiento según la invención. Las células vegetales y las plantas de este tipo sintetizan un almidón modificado. Por tanto, la presente invención también se refiere al almidón sintetizado por las células vegetales y plantas según la invención, además de a procedimientos para la preparación de este almidón y a la preparación de derivados de almidón de este almidón modificado.
Con respecto a la creciente importancia actualmente atribuida a constituyentes vegetales como fuentes de material de partida renovables, una de las tareas de la investigación biotecnológica es intentar adaptar estos materiales de partida vegetales para adaptar los requisitos de la industria de procesamiento. Además, con el fin de permitir regenerar materiales de partida que van a usarse en tantas áreas de aplicación como sean posibles, es necesario lograr una gran variedad de materiales.
El polisacárido almidón está constituido por componentes base químicamente uniformes, moléculas de glucosa, pero constituye una mezcla compleja de diferentes formas de moléculas que presentan diferencias con respecto al grado de polimerización y ramificación y, por tanto, se diferencia fuertemente entre sí en sus características físico-químicas.
Se discrimina entre almidón de amilosa, un polímero esencialmente no ramificado preparado a partir de unidades de glucosa glicosídicamente unidas por alfa-1,4, y almidón de amilopectina, un polímero ramificado en el que las ramas se producen por la aparición de enlaces alfa-1,6-glicosídicos adicionales. Otra diferencia adicional entre amilosa y amilopectina radica en el peso molecular. Mientras que la amilosa, dependiendo del origen del almidón, tiene un peso molecular de 5x105-106 Da, el de la amilopectina se encuentra entre 107 y 108 Da. Las dos macromoléculas pueden diferenciarse por su peso molecular y sus diferentes características físico-químicas que pueden mostrarse fácilmente la mayoría de las veces por sus diferentes características de unión a yodo.
La amilosa se ha considerado desde hace tiempo como un polímero lineal que está constituido por monómeros de alfa-D-glucosa ligados glicosídicamente por alfa-1,4. Sin embargo, en estudios más recientes se ha mostrado la presencia de puntos de ramificación glicosídicos en alfa-1,6 (aproximadamente el 0,1%) (Hizukuri y Takagi, Carbohydr. Res. 134, (1984), 1-10; Takeda y col., Carbohydr. Res. 132, (1984), 83-92).
Las propiedades funcionales tales como, por ejemplo, la solubilidad, comportamiento de retrogradación, capacidad de unión al agua, propiedades formadoras de películas, viscosidad, propiedades de gelatinización, estabilidad a la congelación-descongelación, estabilidad a ácidos, concentración de gel y el tamaño de gránulos de almidón de los almidones están influidos, entre otras cosas, por la relación de amilosa/amilopectina, peso molecular, patrón de distribución de cadenas laterales, contenido de iones, contenido de lípidos y proteínas, tamaño promedio de gránulos de almidón, morfología de gránulos de almidón, etc. Las propiedades funcionales del almidón también están influidas por el contenido de fosfato, un componente no carbonado del almidón. Aquí se hace diferencia entre fosfato, que está unido covalentemente en forma de monoésteres a las moléculas de glucosa del almidón (descritas a continuación como fosfato de almidón), y fosfato en forma de fosfolípidos asociados al almidón. Además del contenido de fosfato, la influencia sobre las propiedades funcionales del almidón también depende en este caso de la forma (fosfato o fosfolípido de almidón) en el que el fosfato se produce en el almidón (Jane y col., 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832).
El contenido de fosfato de almidón varía según la especie de planta. Por tanto, ciertos mutantes de maíz, por ejemplo, sintetizan un almidón con elevado contenido de fosfato de almidón (0,002% de maíz ceroso y 0,013% de maíz de alta amilosa), mientras que tipos convencionales de maíz sólo tienen trazas de fosfato de almidón. Asimismo, pequeñas cantidades de fosfato de almidón se encuentran en trigo (0,001%), mientras que no pudo detectarse fosfato de almidón en avena y sorgo. Asimismo, en los mutantes de arroz se encontró menos fosfato de almidón (0,003% de arroz ceroso) que en especies convencionales de arroz (0,013%). Se detectaron cantidades significativas de fosfato de almidón en plantas sintetizadoras de almidón almacenadoras en tubérculos o raíces tales como, por ejemplo, tapioca (0,008%), boniato (0,011%), arrurruz (0,021%) o patata (0,89%). Los valores en porcentaje del contenido de fosfato de almidón citados anteriormente se refieren al peso seco de almidón en cada caso y han sido determinados por Jane y col. (1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832).
El fosfato de almidón puede estar presente en forma de monoésteres en la posición C-2, C-3 o C-6 de los monómeros de glucosa polimerizada (Takeda y Hizukuri, 1971, Starch/Stärke 23, 267-272). La distribución de fosfato del fosfato de almidón en almidón sintetizado por plantas se distingue generalmente por el hecho que aproximadamente del 30% al 40% de los residuos de fosfato están covalentemente unidos en la posición C-3 y aproximadamente del 60% al 70% del residuo de fosfato está covalentemente unido en la posición C-6 de la molécula de glucosa (Blennow y col., 2000, Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211-218). Blennow y col. (2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174) han determinado un contenido de fosfato de almidón que está unido en la posición C-6 de la molécula de glucosa para diversos almidones tales como, por ejemplo, almidón de patata (entre 7,8 y 33,5 nmoles por mg de almidón, dependiendo del tipo), almidón de diversas especies de Curcuma (entre 1,8 y 63 nmoles por mg), almidón de tapioca (2,5 nmoles por mg de almidón), almidón de arroz (1,0 nmoles por mg de almidón), almidón de judía mungo (3,5 nmoles por mg de almidón) y almidón de sorgo (0,9 nmoles por mg de almidón). Estos autores no han podido mostrar ningún fosfato de almidón unido en la posición C-6 en almidón de cebada y almidones de diferentes mutantes cerosos de maíz. Hasta la fecha no ha sido posible establecer una conexión entre el genotipo de una planta y el contenido de fosfato de almidón (Jane y col., 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832). Por tanto, actualmente no es posible influir el contenido de fosfato de almidón en plantas por medio de cultivo.
En plantas transgénicas puede variar la cantidad de fosfato de almidón en almidones de almacenamiento. Por tanto, el almidón de almacenamiento de plantas de patata que presentan una actividad reducida de sintasa III de almidón soluble (Abel y col., 1996, The Plant Journal 10(6), 9891-991), enzima I de ramificación (BEI) (Safford y col., 1998, Carbohydrate Polymers 35, 155-168), enzima II de ramificación (BEII) (Jobling y col., 1999, The Plant Journal 18, 163-171), BEI y BEII (Schwall y col., 2000, Nature Biotechnology 18, 551- 554), una enzima de desproporción (documento WO 96 27673) o una enzima de desproporción y una BEI (documento WO 95 07355) muestran un contenido elevado de fosfato de almidón en comparación con almidón de plantas naturales correspondientes. Sin embargo, la alteración en el contenido de fosfato de almidón en estas plantas no es debida a las proteínas cuya actividad está reducida en estas plantas, participando directamente en la introducción de residuos de fosfato en el almidón. Por tanto, el aumento en el contenido de fosfato de almidón en las plantas transgénicas en cuestión no es un efecto primario, sino secundario, que se provoca mediante la reducción de las proteínas correspondientes. La razón para el aumento en el contenido de fosfato de almidón como resultado de la modificación de dichas actividades de proteínas está aún sin explicar. Por tanto, no es posible modificar específicamente el contenido de fosfato de almidón modificando las actividades de proteínas que sólo influyen el contenido de fosfato de almidón por un efecto secundario. Además, el modificar las actividades de proteínas que como efecto secundario tienen una influencia sobre el contenido de fosfato de almidón en plantas también provoca...
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para identificar una proteína que presenta actividad enzimática fosforilante de alfa-1,4-glucanos y requiere alfa-1,4-glucanos fosforilados como sustrato en el que
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteína con actividad enzimática fosforilante de alfa-1,4-glucanos usa almidón fosforilado como sustrato.
3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que la proteína con actividad enzimática fosforilante de alfa-1,4-glucanos procede de una planta.
4. Una proteína que requiere alfa-1,4-glucanos fosforilados como sustrato e introduce enlaces monoéster de fosfato en la posición C-3 de una molécula de glucosa del alfa-1,4-glucano, caracterizada porque su secuencia de aminoácidos codificante tiene un dominio de fosfohistidina que tiene al menos el 60% de identidad con el dominio de fosfohistidina como se identifica en SEQ ID No. 5.
5. Un procedimiento para identificar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta actividad enzimática fosforilante de alfa-1,4-glucanos en el que
6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que oligonucleótidos de ácidos nucleicos basados en la secuencia de aminoácidos determinada según la Etapa b) se preparan para identificar dicha molécula de ácido nucleico según la Etapa c).
7. Un procedimiento para identificar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta actividad enzimática fosforilante de alfa-1,4-glucanos en el que
8. Una célula vegetal genéticamente modificada caracterizada porque la modificación genética consiste en la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la planta, en la que la molécula de ácido nucleico extraña codifica una proteína según la reivindicación 4, en la que la célula vegetal genéticamente modificada sintetiza un almidón modificado que tiene un contenido elevado de fosfato de almidón y/o una distribución de fosfato modificada en comparación con almidón de plantas naturales correspondientes.
9. La célula vegetal según la reivindicación 8, en la que el almidón modificado se caracteriza porque presenta un contenido elevado de fosfato unido covalentemente al almidón en la posición C-3 de la molécula de glucosa en comparación con almidón de células vegetales naturales correspondientes.
10. Una planta que contiene células vegetales genéticamente modificadas según una de las reivindicaciones 8 ó 9.
11. La planta según la reivindicación 10, que es una planta de maíz, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, mandioca, patata, sagú, judía mungo, guisante o sorgo.
12. La planta según la reivindicación 11, que es una planta de maíz o trigo.
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