PROCEDIMIENTOS MEJORADOS DE SINTESIS DE PROTEINAS IN VITRO.

Mezcla de reacción para transcripción in vitro de ARNm y/o la traducción de polipéptidos,

comprendiendo la mezcla:

un extracto de células bacterianas crecido en medio que contiene glucosa y que comprende vesículas de membrana invertida que contienen componentes de la cadena respiratoria y el F1F0ATPase; componentes de maquinaria de síntesis de polipéptidos y/o ARNm; una plantilla para la transcripción de dicho ARNm y/o la traducción de dicho polipéptido; nucleótidos y/o aminoácidos para la síntesis de dicho ARNm y/o polipéptidos; y cofactores, enzimas y otros reactivos necesarios para dicha transcripción y/o traducción;

en la que dicha mezcla de reacción está prácticamente exenta de polietileno glicol; comprende magnesio en una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM y comprende uno o más de espermina, espermidina y putrescina;

en la que la mezcla de reacción proporciona condiciones que permiten la transcripción in vitro de ARNm y/o traducción de polipéptidos; y la activación de la fosforilación oxidativa, que es sensible a inhibidores de la cadena de transporte de electrones

Procedimientos mejorados de síntesis de proteínas in vitro.

Antecedentes de la invención

La síntesis de proteínas es un proceso biológico fundamental que subyace en el desarrollo de productos terapéuticos de polipéptidos, diagnósticos y enzimas industriales. Con el advenimiento de la tecnología de ADN recombinante (ADNr), se ha hecho posible aprovechar la maquinaria catalítica de la célula para producir una proteína deseada. Esto se puede lograr en el entorno celular o in vitro usando extractos derivados de las células.

Durante la última década, la productividad de los sistemas libres de células ha mejorado en 2 órdenes de magnitud, de alrededor de 5 mg/ml-hr a aproximadamente 500 mg/ml-hr. Este logro ha hecho la síntesis de proteínas in vitro una técnica práctica para la investigación en laboratorio, y proporciona una tecnología de plataforma para la expresión de proteínas de alto rendimiento. También comienza a sugerir la posibilidad de utilización de tecnologías libres de células como medio alternativo para la producción in vivo a gran escala de productos farmacéuticos de proteínas.

La síntesis de proteínas libre de células ofrece varias ventajas sobre los procedimientos de expresión de proteínas convencionales, in vivo. Los sistemas libres de células puede dirigirse a la mayoría, si no a todos, los recursos metabólicos de la célula a la producción exclusiva de una proteína. Por otra parte, la falta de una pared de célula y los componentes de membrana in vitro es ventajosa, ya que permite el control del entorno de la síntesis. Por ejemplo, los niveles de ARNt se pueden cambiar para reflejar el uso de codones de genes que se expresan. El potencial redox, el pH, o la fuerza iónica también pueden modificarse con mayor flexibilidad que in vivo, ya que no están preocupados por el crecimiento o la viabilidad de las células. Además, la recuperación directa de productos proteínicos purificados, plegados adecuadamente se puede alcanzar fácilmente.

La traducción in vitro también se reconoce por su capacidad para incorporar aminoácidos antinaturales y etiquetados con isótopos, así como su capacidad para producir proteínas que son inestables, insolubles, o citotóxicas in vivo. Además, la síntesis de proteínas libre de células puede jugar un papel en la revolución de la ingeniería de proteínas y las tecnologías de cribado proteómicas. El procedimiento libre de células esquiva los laboriosos procesos necesarios requeridos para la clonación y la transformación de las células para la expresión de nuevos productos génicos in vivo, y se está convirtiendo en una plataforma tecnológica para este campo.

A pesar de todas las características prometedoras de la síntesis de proteínas libres de células, su uso práctico y su aplicación a gran escala ha sido limitada por varios obstáculos. Entre estos obstáculos están los cortos tiempos de reacción y las bajas tasas de producción de proteínas, que producen bajos rendimientos de la síntesis de proteínas y un costo excesivo de reactivos. El trabajo pionero de Spirin et al. (1988) Science 242:1162-1164 eludieron inicialmente el problema del corto tiempo de reacción con el desarrollo de un sistema de flujo continuo. Muchos laboratorios han duplicado y mejorado este trabajo, pero todos han usado principalmente procedimientos que suministran constantemente sustratos a la cámara de reacción. Esta aproximación aumenta la duración de la reacción de la traducción y la producción de proteínas en comparación con el sistema de lotes. Sin embargo, es ineficiente en el uso de reactivos caros, por lo general produce un producto disoluto, y no ha proporcionado mejoras significativas en los índices de producción.

El sistema de proceso por lotes convencional ofrece varias ventajas sobre los esquemas continuos y semicontinuos, que incluyen la facilidad de ampliación, reproducción, aumento de los índices de producción de proteínas, la comodidad, la aplicabilidad de formatos multiplexados para expresión de alto rendimiento, y el uso de sustratos más eficientes. Estas ventajas hacen de la mejora de la productividad del sistema del proceso por lotes crucial para la utilización industrial de la síntesis de proteínas libres de células. Recientemente, se ha informado de una serie de hallazgos que empezar a dilucidar las causas de la terminación anticipada de la síntesis de proteínas en las reacciones de lotes. Además, Kim y Swartz (2001) Biotechnol Bioeng. 74:309-316; Kim y Swartz (1999) Biotechnol Bioeng. 66:180-188 han demostrado que la duración de la reacción de lotes convencional podría extenderse desde 20 minutos hasta un máximo de 2 horas con el uso de nuevos sistemas de regeneración de energía. Si bien estas aproximaciones son prometedoras, todavía hay una tremenda necesidad de desarrollar un proceso comercial viable económicamente. Aumentar el rendimiento del producto mediante la mejora del índice de producción de proteínas y la ampliación del tiempo de reacción es un componente esencial para satisfacer esta necesidad. Reducir el coste de los reactivos de síntesis de proteínas, especialmente la fuente de energía química, es otro componente importante.

Literatura relevante

Patente US 6.337.191 B1, Swartz et al. Kim y Swartz (2000) Biotechnol Prog. 16:385-390; Kim y Swartz (2000) Biotechnol Lett. 22:1537-1542; Kim y Choi (2000) J Biotechnol. 84:27-32; Kim et al. (1996) Eur J Biochem. 239:881-886.

Descripción de la invención

Se proporcionan composiciones y procedimientos para síntesis in vitro de moléculas biológicas. En particular, la presente invención proporciona una mezcla de reacción para la transcripción in vitro de ARNm y/o la traducción de polipéptidos, comprendiendo la mezcla:

un extracto de células bacterianas crecidas en medio que contienen glucosa y que comprende vesículas de membrana invertida que contienen componentes de cadena respiratoria y F₁F₀ATPase; componentes de polipéptidos y/o maquinaria de síntesis de ARNm; una plantilla para la transcripción de dicho ARNm y/o la traducción de dicho polipéptido; nucleótidos y/o aminoácidos para la síntesis de dicho ARNm y/o dichos polipéptidos; y cofactores, enzimas y otros reactivos necesarios para dicha transcripción y/o traducción;

en donde dicha mezcla de reacción está prácticamente exenta de polietileno glicol; comprende magnesio en una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM y comprende una o más de espermina, espermidina y putrescina;

en donde la mezcla de reacción proporciona las condiciones que permitan la transcripción in vitro de ARNm y/o la traducción de polipéptidos; y la activación de la fosforilación oxidativa, que es sensible a los inhibidores de la cadena de transporte de electrones.

Las condiciones óptimas para la síntesis permiten la activación in vitro de la fosforilación oxidativa en la mezcla de reacción, que proporciona un rendimiento mejorado del producto de la síntesis. Las condiciones también proporcionan un aumento del rendimiento de los polipéptidos biológicamente activos, mediante la mejora de las condiciones para el plegado. La activación de la fosforilación oxidativa se puede evidenciar por la capacidad de la mezcla de reacción para generar la síntesis de un polímero en ausencia de fuentes de energía secundarias o intermediarios glucolíticos que actualmente se utilizan. La activación de la fosforilación oxidativa también puede demostrarse por la sensibilidad de la mezcla de reacción a los inhibidores específicos de esta vía.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una gráfica que representa la síntesis de proteínas in vitro con el sistema de componentes de la presente invención, en ausencia y en presencia de piruvato añadido. Incluso en ausencia de piruvato añadido, se produce una síntesis de proteínas significativa.

La Figura 2 es una gráfica de barras que representa el nivel de la síntesis de proteínas, comparando los extractos de bacterias cultivadas en diferentes condiciones. Se puede observar que el extracto de células producidas por bacterias cultivadas en un medio que contiene glucosa proporciona unos resultados mucho mejores, así como la ausencia de PEG en la mezcla de reacción.

Figura 3. Dependencia de magnesio del sistema. Se incubaron reacciones de 15 µl durante 6 horas con cantidades crecientes de Mg. La concentración de Mg que se muestra incluye el...

1. Mezcla de reacción para transcripción in vitro de ARNm y/o la traducción de polipéptidos, comprendiendo la mezcla:

un extracto de células bacterianas crecido en medio que contiene glucosa y que comprende vesículas de membrana invertida que contienen componentes de la cadena respiratoria y el F₁F₀ATPase; componentes de maquinaria de síntesis de polipéptidos y/o ARNm; una plantilla para la transcripción de dicho ARNm y/o la traducción de dicho polipéptido; nucleótidos y/o aminoácidos para la síntesis de dicho ARNm y/o polipéptidos; y cofactores, enzimas y otros reactivos necesarios para dicha transcripción y/o traducción;

en la que dicha mezcla de reacción está prácticamente exenta de polietileno glicol; comprende magnesio en una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM y comprende uno o más de espermina, espermidina y putrescina;

en la que la mezcla de reacción proporciona condiciones que permiten la transcripción in vitro de ARNm y/o traducción de polipéptidos; y la activación de la fosforilación oxidativa, que es sensible a inhibidores de la cadena de transporte de electrones.

2. Mezcla de reacción según la reivindicación 1, en la que los componentes son capaces de utilizar una plantilla de ARNm para sintetizar un polipéptido.

3. Mezcla de reacción según la reivindicación 1, en la que los componentes son capaces de utilizar una plantilla de ADN para sintetizar ARNm.

4. Mezcla de reacción según la reivindicación 1, en la que dicho extracto biológico libre de células comprende un extracto de E. coli crecido en medio que contiene glucosa.

5. Mezcla de reacción según la reivindicación 4, en la que dicho E. coli se cultiva en medio que contiene glucosa y fosfato.

6. Procedimiento para la transcripción in vitro de ARNm y/o la traducción de polipéptidos, comprendiendo el procedimiento:

sintetizar dicho ARNm y/o polipéptidos en una mezcla de reacción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha transcripción de ARNm y/o traducción de polipéptidos es por lo menos tres veces superior a la síntesis en la ausencia de dicho fosforilación oxidativa.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en la que dicha síntesis de macromoléculas biológicas se realiza como una reacción de lotes o una reacción continua.

9. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido comprende al menos un enlace de disulfuro.