PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE PLANTAS TRANSGENICAS CARACTERIZADAS POR RESISTENCIA DURADERA A LOS GEMINIVIRUS.

Secuencia de genes V1/AR1/AV1 o C1/AL1/AC1 mutados de un geminivirus que infecta al tomate,

en la que las mutaciones consisten en mutaciones puntuales distribuidas a lo largo de la secuencia de tal modo que la homología continua entre la secuencia mutada y la secuencia de genes virales correspondiente se encuentra por debajo de o es igual a 8 nucleótidos, preferentemente por debajo de o igual a 5 nucleótidos, codificando la citada secuencia mutada para una proteína de la cápside de tipo natural o para una proteína Rep truncada, respectivamente

Procedimiento para la preparación de plantas transgénicas caracterizadas por resistencia duradera a los geminivirus.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de plantas transgénicas de resistencia duradera a los geminivirus.

De forma más en particular, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de plantas transgénicas de resistencia duradera a los geminivirus, en el que el transgen consta de una secuencia de polinucleótidos, procedente del patógeno, modificada de forma adecuada a efectos de dar como resultado una diana ineficaz del silenciamiento génico post-transcripcional inducido por los geminivirus.

Se sabe que los geminivirus son un tipo de virus de plantas amplio y diversificado que infecta varias plantas de interés agronómico, lo que causa graves pérdidas en las cosechas. Dichos virus se caracterizan por viriones que constan de dos partículas icosaédricas geminadas. Su genoma, que consta de una o dos moléculas circulares de ADN monocatenario (ADNmc), se replica en el núcleo de células infectadas a través de compuestos intermedios bicatenarios (Hanley-Bowdoin y col., 1999).

La familia Geminiviridae se divide en cuatro géneros denominados Mastrevirus, Begomovirus, Curtovirus y Topocuvirus en base al insecto vector, el espectro del huésped y la estructura del genoma (Briddon y col., 1985; Fauquet y col., 2003).

Una grave enfermedad de la planta del tomate, transmitida por la mosca blanca Bemisia tabaci, se conoce desde hace mucho tiempo como "rizadura amarilla del tomate" en las áreas del Oriente Medio, Sudeste Asiático y África, (Czosnek y col., 1997). Esta enfermedad, que puede causar pérdidas en las cosechas del 100% (Pico y col., 1996; Czosnek y col., 1997), se difunde de forma sucesiva tanto a través del Mediterráneo Occidental, alcanzando Cerdeña, Sicilia y España (Czosnek y col., 1997), como a través de América (Polston y col., 1997).

Recientemente se han identificado y aislado los agentes de la enfermedad, que son virus que pertenecen a la familia Geminiviridae, género Begomovirus. Estudios filogenéticos han resaltado la presencia de distintas especies virales relacionadas con los distintos orígenes geográficos del Begomovirus: Asia, África y América (Czosnek y col., 1997).

El genoma de las especies de Cerdeña del virus de la rizadura amarilla del tomate (TYLCSV, por sus siglas en inglés), es monopartito (Kheyr-Pour y col., 1991). El ADN se transcribe de forma bidireccional y contiene seis marcos de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés), dos en la cadena viral (V): V1 y V2 y cuatro en la cadena complementaria (C): C1, C2, C3 y C4, tal como se muestra en la figura 1. Entre los ORFs C1 y V2 hay una región no codificante denominada región intergénica (IR, por sus siglas en inglés) análoga a la que se encuentra presente en el genoma de todos los virus de la familia Geminiviridae. La organización genómica del TYLCSV es estructuralmente similar a la del componente A de los Begomovirus bipartitos, tales como el virus del mosaico dorado del tomate (TGMV, por sus siglas en inglés) y el virus del ñame africano (ACMV, por sus siglas en inglés). En el caso de los Begomovirus bipartitos la nomenclatura de los ORFs presentes en el componente A de la cadena complementaria es: AL1 o AC1, AL2 o AC2, AL3 o AC3, AL4 o AC4, mientras que en la cadena viral es AR1 o AV1, AR2 o AV2; en la cadena complementaria del componente B la nomenclatura es: BL1 o BC1 y en la cadena viral es BR1 o BV1.

Las estrategias usadas hasta ahora para controlar la infección de los geminivirus transmitida por la Bemisia tabaci se basan en el uso de costosos tejidos con mallas finas (para el cultivo de tomates frescos) y en particular en los tratamientos reiterados con insecticidas (en el cultivo tanto de tomates frescos, como de tomate de industria). Dichas estrategias dan como resultado un aumento de los gastos de producción y representan un serio peligro para la salud de los operarios agrícolas y de los consumidores. Además, ya se ha informado la aparición de poblaciones de Bemisia tabaci resistentes al insecticida imidacloprid (Cahill y col., 1996; Williams y col., 1996).

El desarrollo de especies cultivadas resistentes representa la forma más práctica y económica para controlar las infecciones virales. Los programas clásicos de mejora genética para la introducción de resistencia a los geminivirus que causan la rizadura amarilla del tomate se basaban en la transferencia de genes de resistencia procedentes de especies silvestres de Lycopersicon a especies cultivadas de tomate. De ese modo, se han obtenido y comercializado líneas con niveles variables de resistencia al TYLCSV, mostrando las mejores líneas síntomas reducidos y baja replicación viral. No obstante, las plantas con niveles bajos y medios de resistencia representan un receptáculo potencial para infecciones posteriores.

Otro aspecto importante a tener en cuenta es que las características agronómicas de las líneas obtenidas no son siempre óptimas y sin embargo reflejan a las de los genotipos de los tomates de cultivo utilizados en los programas de mejora genética.

Aún no se ha producido una línea de tomate inmune a los virus que causan la enfermedad de la rizadura amarilla del tomate, a saber, sin síntomas y sin replicación de ADN viral.

Con la llegada de la ingeniería genética se abrieron nuevas perspectivas para la introducción de caracteres de resistencia contra virus de plantas. La mayoría de las estrategias se basan en la introducción y la expresión de secuencias procedentes de patógenos en la planta de interés, resistencia procedente de patógenos (PDR, por sus siglas en inglés) (Sanford y Johnson, 1985; Abel y col., 1986; Tavazza y Lucioli, 1993).

Aunque dichas estrategias se han aplicado con éxito para la introducción de caracteres de resistencia hacia virus de plantas con genoma de ARN (Beachy, 1997), en el caso de los geminivirus, con un genoma de ADN, la expresión de secuencias procedentes de patógenos ha producido plantas sin resistencia duradera y/o sin tolerancia.

Los mecanismos que inducen resistencia a los virus logrados a través de la expresión de secuencias procedentes de patógenos se pueden agrupar en dos amplias categorías:

El silenciamiento génico post-transcripcional es un proceso omnipresente en los eucariotas, que implica la degradación de ARNs específicos después de la formación de moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) que tienen secuencias homólogas a las del ARN diana.

Aunque pueden existir distintos contextos capaces de inducir la producción de ARNbc homólogo al transgen (transcripción de ARNs transgénicos aberrantes, presencia en el ARN transgénico de secuencias invertidas y repetidas lo suficientemente largas, integración del transgen en el genoma de la planta en copias múltiples invertidas y repetidas), una vez que se produce el ARNbc, éste último se reconoce y se degrada en moléculas cortas de ARNbc de aproximadamente 21-26 nucleótidos, conocidas como ARNip.

A continuación los ARNip se integran en un complejo de multiproteína denominado RISC, que es capaz de degradar todos los ARNs que tienen homología de secuencia con los ARNip. Los últimos representan, por consiguiente, los factores determinantes de la especificidad del silenciamiento del ARN y su presencia relacionada con una secuencia determinada establece de forma unívoca que esta secuencia de ARN se encuentra silenciada post-transcripcional- mente.

Por consiguiente, las plantas transgénicas silenciadas post-transcripcionalmente para secuencias procedentes del genoma de ARN viral, son resistentes al virus homólogo y a los virus con secuencias de nucleótidos estrechamente relacionadas con el transgen.

El silenciamiento del transgen también se puede inducir después de la infección por el virus.

De hecho, la replicación viral es capaz de inducir el silenciamiento de un transgen, inicialmente no silenciado, si la secuencia de nucleótidos del transgen es homóloga a una parte del genoma del virus infectante. La activación del mecanismo de silenciamiento implica...

1. Secuencia de genes V1/AR1/AV1 o C1/AL1/AC1 mutados de un geminivirus que infecta al tomate, en la que las mutaciones consisten en mutaciones puntuales distribuidas a lo largo de la secuencia de tal modo que la homología continua entre la secuencia mutada y la secuencia de genes virales correspondiente se encuentra por debajo de o es igual a 8 nucleótidos, preferentemente por debajo de o igual a 5 nucleótidos, codificando la citada secuencia mutada para una proteína de la cápside de tipo natural o para una proteína Rep truncada, respectivamente.

2. Secuencia de genes V1/AR1/AV1 mutados, según la reivindicación 1, que codifica para una proteína de la cápside, teniendo la citada proteína la secuencia con el SEQ ID No. 7.

3. Secuencia de genes V1/AR1/AV1 mutados, según la reivindicación 2, teniendo la citada secuencia de genes la secuencia con el SEQ ID No. 6.

4. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según la reivindicación 1, que codifica proteínas Rep truncadas que constan de entre 130 aminoácidos (Rep 130) y 210 aminoácidos (Rep 210), teniendo lugar el citado truncamiento en el extremo terminal 3'.

5. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según la reivindicación 4, que codifica para la proteína Rep 210 que tiene la secuencia de proteína con el SEQ ID No. 3.

6. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según la reivindicación 5, teniendo la citada secuencia de genes la secuencia con el SEQ ID No. 2.

7. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según la reivindicación 4, que codifica para la proteína Rep 210 que tiene la secuencia de proteína con el SEQ ID No. 5.

8. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según la reivindicación 7, teniendo la citada secuencia de genes la secuencia con el SEQ ID No. 4.

9. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados que codifica para la proteína Rep 130 que tiene la secuencia de proteína con el SEQ ID No. 9.

10. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según la reivindicación 9, teniendo la citada secuencia de genes la secuencia con el SEQ ID No. 8.

11. Secuencia de genes mutados, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el geminivirus que infecta el tomate es el TYLCSV.

12. Construcción sintética que comprende una secuencia de polinucleótidos heterólogos que contiene en la dirección 5'-3':

13. Vector de expresión que comprende la construcción definida según la reivindicación 12.

14. Planta transgénica, tejido o células de planta de la misma, que comprende en su genoma una secuencia de genes mutados según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

15. Semilla que comprende en su genoma una secuencia de genes mutados según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

16. Procedimiento para la preparación de plantas transgénicas, tejido de plantas o células de las mismas que tienen resistencia de larga duración contra los geminivirus, que incluye las siguientes etapas:

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la citada homología continua entre la secuencia mutada y la secuencia de genes virales correspondiente de la etapa a) está por debajo o es igual a 5 nucleótidos.

18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, en el que los geminivirus se seleccionan entre el grupo constituido por las especies de Mastrevirus, Curtovirus, Begomovirus y Topocuvirus y aislados de los mismos.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que las especies de Begomovirus son TYLCCNV, TYLCGV, TYLCMalV, TYLCSV, TYLCTHV, TYLCV, ACMV, BGMV, CaLCuV, ToCMoV, TGMV, ToGMoV, ToMHV, ToMoTV, ToMoV, ToRMV, ToSLCV, ToSRV, virus del arrugamiento de las hojas de algodón (CLCrV, CLCuAV, ClCuGV, CLCuKV, CLCuMV, CLCuRV), virus del mosaico del ñame del Este de África (EACMCV, EACMMV, EACMV, EACMZV), virus del mosaico amarillo de la patata (PYMPV, PYMTV, PYMV), virus de la rizadura de la calabaza (SLCCNV, SLCV, SLCYV), virus de la rizadura de la batata (SPLCGV, SPLCV), virus de la rizadura del tabaco (TbLCJV, TbLCKoV, TbLCYNV, TbLCZV), virus de la rizadura del tomate (ToLCBV, ToLCBDV, ToLCGV, ToLCKV, ToLCLV, ToLCMV, ToLCNDV, ToLCSLV, ToLCTWV, ToLCVV, ToLCV) y aislados de los mismos.

20. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que las especies que pertenecen al género Mastrevirus, Curtovirus, Topocuvirus se seleccionan entre el grupo constituido por WDV, MSV, SSV, BYDV, TYDV, BCTV y aislados de los mismos.

21. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que la secuencia de genes se selecciona entre el grupo constituido por C1/AL1/AC1, C2/AL2/AC2, C3/AL3/AC3, C4/AL4/AC4, V1/AR1/AV1, V2/AR2/AV2, BC1/BL1 y BV1/BR1, que pertenecen a los geminivirus.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la secuencia de genes C1/AL1/AC1 pertenece al TYLCSV.

23. Procedimiento según las reivindicaciones 16 y 22, en el que la secuencia de aminoácidos es una proteína truncada en relación con la proteína viral de tipo natural.

24. Procedimiento según las reivindicaciones 16 a 19 y 23, en el que las secuencias de genes virales hechas dianas ineficaces del silenciamiento génico post-transcripcional inducido por virus son el SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 2 e SEQ ID No. 4.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que las proteínas truncadas son el SEQ ID No. 9 ó el SEQ ID No. 3 ó el SEQ ID No. 5.

26. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la secuencia de genes V1/AR1/AV1 pertenece al TYLCSV.

27. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, 21 y 26, en el que la secuencia de genes virales hecha una diana ineficaz del silenciamiento génico post-transcripcional inducido por virus es el SEQ ID No. 6 que codifica para el SEQ ID No. 7 de la proteína de la cápside.

28. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27, en el que las plantas, tejidos o células de las mismas pertenecen al grupo constituido por tomate, pimiento, tabaco, calabaza, ñame, batata, algodón, melón, patata, soja, maíz, trigo, caña de azúcar, judías, remolacha.