Método para la producción de una planta no transgénica, que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina comprendiendo:

(a) la introducción en células vegetales de una oligonucleobase recombinagénica con una mutación objetivo en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen EPSPS mutante que expresa una proteína EPSP que es mutada en una o más posiciones de aminoácidos, dichas posiciones siendo seleccionadas en el grupo que consiste en Leu173, Ala179, Met180, Arg181, Ser98, Ser255 y Leu198 en la proteína EPSPS de Arabidopsis o en un residuo de aminoácido análogo en un gen EPSP de otra especie;

(b) la identificación de una célula vegetal que presenta un crecimiento normal, en comparación con una célula vegetal de tipo salvaje correspondiente en presencia de glifosato; y

(c) la regeneración de una planta no transgénica resistente o tolerante al herbicida que posee dicho gen EPSPS mutado a partir de dicha célula vegetal;

donde la planta no transgénica, resistente o tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normales en comparación con el de las plantas correspondientes de tipo salvaje y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalítica en comparación con la de la enzima de tipo salvaje

Plantas no transgénicas resistentes a un herbicida.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de una planta no transgénica resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina, por ejemplo, glifosato. La presente invención también se refiere al uso de una oligonucleobase recombinagénica para que se realice una mutación deseada en las secuencias cromosómicas o episómicas de una planta en el gen codificante con respecto a una 5-enol piruvil-shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). La proteína mutada, que mantiene sustancialmente la actividad catalítica de la proteína de tipo salvaje, permite una mayor resistencia o tolerancia de la planta frente a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina, y permite el crecimiento o desarrollo sustancialmente normales de la planta, de sus órganos, tejidos o células en comparación con la planta de tipo salvaje independientemente de la presencia o ausencia del herbicida. La presente invención también se refiere a una célula vegetal no transgénica en la que ha mutado el gen EPSPS, una planta no transgénica regenerada a partir de ahí, así como una planta obtenida mediante un cruce utilizando una planta regenerada no transgénica con un gen EPSPS mutado.

2. Antecedentes de la invención

2.1 Herbicidas de fosfonomethilglicina

Las plantas tolerantes al herbicida pueden reducir la necesidad de trabajar el suelo para controlar las malas hierbas reduciendo así eficazmente la erosión del suelo. Un herbicida objeto de mucha investigación a este respecto es la N-fosfonometilglicina, comúnmente denominada glifosato. El glifosato inhibe la vía ácida shiquímica que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos incluyendo aminoácidos, hormonas y vitaminas. Específicamente, el glifosato frena la conversión de ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y ácido 3-fosfoshiquímico en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico por la inhibición del enzimático 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (a partir de ahora denominado sintasa EPSP o EPSPS). Para los objetivos de la presente invención, el término "glifosato" incluye cualquier forma eficaz herbicidamente de la N-fosfonometilglicina (incluyendo cualquier derivado de sal, otras formas con las que se obtiene la producción del ión glifosato en plantas y cualesquiera otras herbicidas de la familia de la fosfonometliglicina.

La tolerancia de las plantas al glifosato puede aumentar con la introducción de un gen mutante EPSPS que tiene una alteración en la secuencia codificante de los aminoácidos EPSPS en el genoma de la planta. Ejemplos de algunas de las mutaciones en el gen EPSPS para inducir la tolerancia al glifosato se describen en las siguientes patentes: patente EEUU nº. 5,310,667; patente EEUU nº. 5,866,775; patente EEUU nº. 5,312,910; patente EEUU nº. 5,145,783. Estas mutaciones propuestas habitualmente tienen un valor k_i más alto para el glifosato que la enzima EPSPS de tipo salvaje que confiere el fenotipo tolerante al glifosato, pero éstas variantes también se caracterizan por un K_m alto de PEP con el que la enzima cinéticamente se vuelve menos eficiente. (Kishore et al., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663; Schulz et al., 1984, Arch. Microbiol. 137: 121-123; Sost et al., 1984, FEBS. Lett 173: 238-241; Kishore et al., 1986, Fed. Proc. 45: 1506; Sost y Amrhein, 1990, Arch. Biochem. Biophys. 282: 433-436.) Muchas mutaciones del gen EPSPS son elegidas con el fin de producir una enzima EPSP que sea resistente a herbicidas, pero desafortunadamente, la enzima EPSPS que produce el gen EPSPS mutado tiene una actividad enzimática significativamente inferior al EPSPS de tipo salvaje. Por ejemplo, el K_m aparente de PEP y el K_i aparente de glifosato para el EPSPS de tipo salvaje de E. coli son de 10 µM y 0.5 µM, mientras que para un aislado tolerante al glifosato que tiene una sola sustitución de aminoácidos de alanina con respecto a la glicina en posición 96, estos valores son de 220 µM y 4.0 mM, respectivamente. Un numero de genes EPSPS tolerantes al glifosato se han construido por mutagénesis. De nuevo, el EPSPS tolerante al glifosato presentaba una eficiencia catalítica inferior (V_max/K_m), como lo mostraba un incremento en el K_m de PEP, y una ligera reducción del V_max de la enzima vegetal de tipo salvaje (Kishore et al., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663).

Como las constantes cinéticas de las enzimas variantes se deterioran con respecto al PEP, se han propuesto unos niveles altos de sobreproducción de la enzima variante, de 40 a 80 veces más, que serán necesarios para mantener una actividad catalítica normal en plantas en presencia de glifosato (Kishore et al., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663). Se ha demostrado que se pueden producir plantas tolerantes al glifosato por inserción en el genoma de la planta de la capacidad para producir un nivel más alto de EPSP sintasa en el cloroplasto de la célula (Shah et al., 1986, Science 233, 478-481), cuya enzima es preferiblemente tolerante al glifosato (Kishore et al.. 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663).

La introducción de los genes EPSPS mutantes exógenos en plantas está bien documentada. Por ejemplo, según la patente EEUU nº. 4,545,060, para incrementar la resistencia de una planta al glifosato, un gen codificante para una variante EPSP que tiene al menos una mutación que hace que la enzima sea más resistente a su inhibidor competitivo, es decir, glifosato, es introducido en el genoma de la planta. No obstante, se asocian muchas complicaciones y problemas con estos ejemplos. Muchas de dichas mutaciones producen una expresión baja del producto genético EPSPS mutado o produce un producto genético EPSPS con una actividad enzimática significativamente inferior en comparación con el tipo salvaje. La expresión baja o actividad enzimática baja de la enzima mutada produce niveles anormalmente bajos de crecimiento y de desarrollo de la planta.

Mientras que estas variantes en las EPSP sintasas han demostrado ser útiles en la obtención de plantas transgénicas tolerantes al glifosato, sería mucho más beneficioso obtener una variante de producto genético EPSPS altamente tolerante al glifosato pero que siga eficiente cinéticamente para que la tolerancia mejorada pueda ser obtenida con un nivel de expresión de tipo salvaje.

2.2 Oligonucleobases recombinagénicas

Las oligonucleobases recombinagénicas y su uso para efectuar cambios genéticos en células eucarióticas se describen en la patente estadounidense nº. 5,565,350 de Kmiec (Kmiec I). Kmiec I enseña un método para la introducción de alteraciones genéticas específicas en un gen objetivo. Kmiec I divulga, entre otras cosas, oligonucleobases recombinagénicas que tienen dos cadenas, en las que la primera cadena contiene dos segmentos de al menos 8 nucleótidos de tipo ARN que son separados por un tercer segmento desde 4 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de tipo ADN, llamado "segmento de ADN interpuesto". Los nucleótidos de la primera cadena en apareamiento de bases de nucleótidos de tipo ADN de una segunda cadena. Las primeras y segundas cadenas son enlazadas adicionalmente por un segmento de nucleótidos monocatenario de modo que las primera y segunda cadenas son partes de una única cadena oligonucleótida. Kmiec I enseña además un método para la introducción de alteraciones genéticas específicas en un gen objetivo. Según Kmiec I, las secuencias de los segmentos RNA son seleccionadas para ser homologas, es decir, idénticas, a la secuencia de un primer y de un segundo fragmento del gen objetivo. La secuencia del segmento interpuesto de ADN es homologa a la secuencia del gen objetivo entre el primer y el segundo fragmento excepto para una región de diferencia, llamada "región heteróloga". La región heteróloga puede efectuar una inserción o deleción, o puede contener una o más bases que no coinciden con la secuencia del gen objetivo con el fin de efectuar una sustitución. Según Kmiec I, la secuencia del gen objetivo es alterada en forma dirigida por la región heteróloga, de manera que el gen objetivo se vuelve homólogo con la secuencia de la oligonucleobase recombinagénica. Kmiec I enseña específicamente que los nucleótidos que contienen ribosa y 2'-O-metilribosa, es decir 2'-metoxiribosa, pueden ser usados en las oligonucleobases recombinagénicas y nucleótidos que contienen deoxiribosa de origen natural, pueden ser utilizados como nucleótidos de tipo ADN.

La patente EEUU nº. 5,731, 181 para Kmiec (Kmiec II) divulga específicamente...

1. Método para la producción de una planta no transgénica, que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina comprendiendo:

donde la planta no transgénica, resistente o tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normales en comparación con el de las plantas correspondientes de tipo salvaje y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalítica en comparación con la de la enzima de tipo salvaje.

2. Método para la producción de una planta no transgénica, que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina, comprendiendo:

donde la planta no transgénica resistente o tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normal en comparación con el de las plantas correspondientes de tipo salvaje, y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalítica en comparación con la de la enzima de tipo salvaje.

3. Método según la reivindicación 1 o 2 en el que la oligonucleobase recombinagénica es un nucleótido dúplex mezclado o un vector mutacional de oligodeoxinucleótido monocatenario (SSMOV).

4. Método según la reivindicación 3 en el que el nucleótido dúplex mezclado contiene una primera región homologa que tiene una secuencia idéntica a la secuencia de al menos 6 pares de bases del primer fragmento del gen EPSPS objetivo y una segunda región homologa que tiene una secuencia idéntica a la secuencia de al menos 6 pares de bases de un segundo fragmento del gen EPSPS objetivo, y una región intermedia que contiene al menos una nucleobase heteróloga al gen EPSPS objetivo, la cual región intermedia conecta las primera y segunda regiones homologas.

5. Método según la reivindicación 1 o 2 en el que la oligonucleobase recombinagénica es introducida por electroporación.

6. Método según la reivindicación 1 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que consiste en Leu₉₇, Ala₁₀₃, Met₁₀₄, Arg₁₀₅, Ser₂₃, Ser₁₇₉ y Leu₁₂₂ en el gen EPSPS de Zea mays.

7. Método según la reivindicación 1 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionados en el grupo que consiste en Leu₁₆₉, Ala₁₇₅, Met₁₇₆, Arg₁₇₇, Ser₉₄, Ser₂₅₁ y Leu₁₉₄ en el gen EPSPS de una especie de Brassica.

8. Método según la reivindicación 1 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que consiste en Leu₁₆₉, Ala₁₇₅, Met₁₇₆, Arg₁₇₇, Ser₉₄, Ser₂₅₁ y Leu₉₄ en el gen EPSPS de Petunia hybrida.

9. Método según la reivindicación 1 o 2 en el que las células vegetales son seleccionadas en el grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, cebada, semilla de soja, algodón, remolacha azucarera, colza, canola, lino, girasol, patata, tabaco, tomate, alfalfa, álamo, pino, eucalipto, manzano, lechuga, guisantes, lentejas, uva, césped y especie de Brassica.

10. Método según la reivindicación 2 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que consiste en Leu₉₇, Ala₁₀₃ Met₁₀₄, Arg₁₀₅, Ser₂₃, Ser₁₇₉ y Leu₁₂₂ en el gen EPSPS de Zea mays.

11. Método según la reivindicación 2 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que consiste en Leu₁₆₉, Ala₁₇₅, Met₁₇₆, Arg₁₇₇, Ser₉₄, Ser₂₅₁ y Leu₁₉₄ en el gen EPSPS de una especie de Brassica.

12. Método según la reivindicación 2 en el que las posiciones de aminoácidos son seleccionadas en el grupo que consiste en Leu₁₈₉, Ala₁₇₅, Met₁₇₆, Arg₁₇₇, Ser₉₄, Ser₂₅₁ y Leu₁₉₄ en el gen EPSPS de Petunia hybrida.

13. Método para la producción de una planta no transgénica que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina comprendiendo:

donde la planta no transgénica, resistente o tolerante al herbicida exhibe un crecimiento y desarrollo normales en comparación con el de las plantas correspondientes de tipo salvaje, y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalítica en comparación con la de la enzima de tipo salvaje.

14. Método según la reivindicación 13 en el que las posiciones de aminoácidos son Thr₁₀₂y Pro₁₀₆ en el gen EPSPS de Zea mays.

15. Método según la reivindicación 13 en el que las posiciones de aminoácidos son Thr₁₇₄ y Pro₁₇₈ en el gen EPSPS de una especie de Brassica.

16. Método según la reivindicación 13 en el que las posiciones de aminoácidos son Thr₁₇₄ y Pro₁₇₈ en el gen EPSPS de Petunia hybrida.