PLANTAS CON MAYOR ACTIVIDAD DE MULTIPLES ENZIMAS FOSFORILADORAS DE ALMIDON.

Célula vegetal genéticamente modificada, que se caracteriza porque tiene una mayor actividad de al menos una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa y al menos una proteína [alfa-1,

4-glucan]-hidro-discinasa en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes que todavía no se han modificado genéticamente, en la que la célula vegetal contiene una primera molécula de ácido nucleico extraña que no se produce de forma natural en la correspondiente célula vegetal salvaje que codifica una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa y una segunda molécula de ácido nucleico extraña que no se produce de forma natural en la correspondiente célula vegetal salvaje que codifica una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa en el genoma de la célula vegetal

Plantas con mayor actividad de múltiples enzimas fosforiladoras de almidón.

La presente invención se refiere a células vegetales y plantas, que están genéticamente modificadas, en las que la modificación genética conduce a un incremento en la actividad de una proteína OK1 de fosforilación de almidón y una proteína R1 de fosforilación de almidón en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes o plantas salvajes que no se han modificado genéticamente. Además, la presente invención se refiere a medios y procedimientos para la fabricación de tales células vegetales y plantas. Las células vegetales y plantas de este tipo sintetizan un almidón modificado. Por tanto, la presente invención también se refiere al almidón sintetizado por las células vegetales y plantas de acuerdo con la invención, a procedimientos para la fabricación de este almidón y a la fabricación de derivados de almidón de este almidón modificado, así como a harinas que contienen almidones de acuerdo con la invención.

Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico y vectores que contienen secuencias que codifican una proteína OK1 y una proteína R1, así como a células huésped que contienen estas moléculas de ácido nucleico.

Con respecto a la creciente importancia que en la actualidad se atribuye a los constituyentes de las plantas como fuentes de materia prima renovables, una de las tareas de la investigación biotecnológica es intentar adaptar estas materias primas vegetales para cumplir los requisitos de la industria del procesamiento. Además, con el fin de permitir que las materias primas regenerantes se usen en la mayor cantidad de áreas de aplicación que sea posible, es necesario conseguir una gran variedad de materiales.

El almidón polisacárido está constituido por componentes de base químicamente uniforme, las moléculas de glucosa, pero constituye una compleja mezcla de diferentes formas moleculares que exhiben diferencias con respecto al grado de polimerización y ramificación, y, por tanto, difieren considerablemente entre sí en sus características fisicoquímicas. Se discrimina entre el almidón de amilasa, un polímero esencialmente no ramificado formado por unidades de glucosa unidas por enlaces alfa-1,4-glicosídicos, y el almidón de amilopectina, un polímero ramificado en el que las ramas se producen por la aparición de enlaces alfa-1,6-glicosídicos adicionales. Otra diferencia esencial entre la amilasa y la amilopectina reside en el peso molecular. Mientras que la amilasa, en función del origen del almidón, tiene un peso molecular de 5x10⁵-10⁶ Da, el de la amilopectina reside entre 10⁷ y 10⁸ Da. Las dos macromoléculas se pueden diferenciar por su peso molecular y sus diferentes características fisicoquímicas, que se pueden hacer más fácilmente visibles por sus diferentes características de enlaces yoduro.

La amilasa siempre se ha visto como un polímero lineal, compuesto por monómeros de alfa-D-glucosa unidos por enlaces alfa-1,4-glicosídicos. No obstante, en los estudios más recientes se ha mostrado la presencia de puntos de ramificación alfa-1,6-glicosídico (aprox. 0,1%) (Hizukuri y Takagi, Carbohydr. Res. 134, (1984), 1-10; Takeda y col. Carbohydr. Res. 132, (1984), 83-92).

Las características funcionales del almidón, tal como, por ejemplo, la solubilidad, el comportamiento de retrogradación, la capacidad de unión al agua, las características de formación de película, la viscosidad, las características de adhesividad, la estabilidad a la congelación-descongelación, la estabilidad al ácido, la fuerza de gelificación, el tamaño del gránulo de almidón de los almidones y otras se ven afectadas por la proporción amilasa/amilopectina, el peso molecular, el patrón de la distribución de las cadenas laterales, la concentración de iones, el contenido de lípidos y proteínas, el tamaño medio del gránulo de almidón del almidón, la morfología del gránulo de almidón etc. Las características funcionales del almidón también se ven afectadas por el contenido en fosfato, un componente que no es carbono del almidón. Se discrimina entre el fosfato que está covalentemente unido a las moléculas de glucosa en forma de monoésteres (designado más adelante como fosfato de almidón) y el fosfato en forma de fosfolípidos con el almidón asociado.

La concentración del fosfato del almidón varía en función del tipo de planta. Por tanto, ciertos mutantes de maíz sintetizan un almidón con una concentración mayor de fosfato de almidón (maíz céreo 0,002% y maíz rico en amilasa 0,013%), mientras que las especies convencionales de maíz sólo tienen trazas de fosfato de almidón. Asimismo se encuentran cantidades pequeñas de fosfato de almidón en trigo (0,001%), mientras que no se ha mostrado la presencia de fosfato de almidón en avena y sorgo. Asimos, se encuentra menos fosfato de almidón en mutantes de arroz que en las especies de arroz convencionales (0,013%). Se han mostrado cantidades significativas de fosfato de almidón en bulbos o en plantas que sintetizan almidón de almacenamiento en la raíz, tales como tapioca (0,008%), batata (0,011%), arruruz (0,021%) o patata (0,089%). Los valores en porcentaje citados en lo que antecede para el contenido en fosfato de almidón se refieren a los respectivos pesos secos del almidón y han sido determinados por Jane y col. (1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832).

El fosfato de almidón puede existir en forma de monoésteres en la posición C-2, C3 o C6 de los monómeros de glucosa polimerizados (Takeda y Hizukuri, 1971, Starch/Stärke 23, 267-272). La distribución del fosfato del fosfato del almidón sintetizado por plantas normalmente muestra que aproximadamente del 30% al 40% de los residuos de fosfato están unidos covalentemente en la posición C-3 y aproximadamente del 60% al 70% de los residuos de fosfato están covalentemente unidos en la posición C-6 de las moléculas de glucosa (Blennow y col., Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211 218). Blennow y col. 2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174) determinaron una concentración de fosfato de almidón que está unido en la posición C-6 de las moléculas de glucosa para varios almidones, tal como almidón de patata (entre 7,8 y 33,5 nMol por mg de almidón, según la especie), almidón de varias especies de Curcuma (entre 1,8 y 63 nMol por mg de almidón), almidón de tapioca (2,5 nMol por mg de almidón), almidón de arroz (1,0 nMol por mg de almidón), almidón de fríjol (3,5 nMol por mg de almidón y almidón de sorgo (0,9 nMol por mg de almidón). Estos autores no pudieron detectar fosfato de almidón unido en la posición C-6 en almidón de cebada y almidón de varias mutantes céreos del maíz. Todavía no se ha establecido ninguna conexión entre el genotipo de una planta y la concentración de fosfato de almidón (Jane y col., 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832). Por tanto, actualmente no es posible afectar a la concentración de fosfato de almidón en plantas a través de medidas de cultivo.

Anteriormente sólo se ha descrito una proteína que produce la introducción de enlaces covalentes de residuos de fosfato en las moléculas de glucosa del almidón. Esta proteína tiene la actividad enzimática de una alfa-glucano hidro-discinasa (GWD, E.C.: 2.7.9.4) (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 7166-7171), a menudo se designa como R1 en la literatura científica y está unida a los gránulos de almidón del almidón para almacenamiento en tubérculos de patata (Loberth y col., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477). En la reacción catalizada por R1, los eductos alfa-1,4-glucano (almidón), adenosinatrifosfato (ATP) y agua se convierten en los productos glucanofosfato (fosfato de almidón), monofosfato y adenosinamonofosfato. Al mismo tiempo, el residuo de gamma-fosfato del ATP se transfiere al agua y el residuo de beta-fosfato del ATP se transfiere al glucano (almidón). El R1 transfiere el residuo beta-fosfato in vitro desde el ATP a la posición C-6 y C-3 de las moléculas de glucosa de alfa-1,4-glucanos. La proporción entre fosfato en C-6 fosfato y el fosfato en C-3 que se obtiene mediante la reacción in vitro corresponde a la proporción que existe en almidón aislado en plantas (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 7166-7171). Dado que aproximadamente el 70% del fosfato de almidón presente en el almidón de patata está unido a los monómeros de glucosa del almidón en la posición C-6 y aproximadamente el 30% en la posición C-3, esto significa que R1 fosforila, preferentemente, la posición C-6 de las moléculas de glucosa. Además, se ha mostrado que, entre otras cosas,...

1. Célula vegetal genéticamente modificada, que se caracteriza porque tiene una mayor actividad de al menos una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa y al menos una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes que todavía no se han modificado genéticamente, en la que la célula vegetal contiene una primera molécula de ácido nucleico extraña que no se produce de forma natural en la correspondiente célula vegetal salvaje que codifica una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa y una segunda molécula de ácido nucleico extraña que no se produce de forma natural en la correspondiente célula vegetal salvaje que codifica una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa en el genoma de la célula vegetal.

2. Célula vegetal genéticamente modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico extraña que codifica una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa codifica una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa de patata, trigo, maíz, arroz, soja, cítricos o Arabidopsis.

3. Célula vegetal genéticamente modificada de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, que sintetiza un almidón modificado en comparación con las correspondientes células vegetales salvajes que no han sido modificadas genéticamente.

4. Célula vegetal genéticamente modificada de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el almidón modificado se caracteriza porque tiene una mayor concentración de fosfato de almidón y/o una distribución del fosfato modificada en comparación con el almidón aislado de las correspondientes células vegetales salvajes que no han sido modificadas genéticamente.

5. Célula vegetal genéticamente modificada de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el almidón modificado se caracteriza porque tiene una proporción modificada entre el fosfato en C-3 y el fosfato en C-6.

6. Planta que contiene células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Planta de acuerdo con la reivindicación 6, que es una planta que almacena almidón.

8. Planta de acuerdo con la reivindicación 7, que es una planta de maíz o una planta de trigo.

9. Material de propagación de plantas de acuerdo con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8, que contienen células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Partes de plantas cosechables de plantas de acuerdo con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8, que contienen células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5.

11. Procedimiento para la fabricación de una planta genéticamente modificada de acuerdo con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8, en el que

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la planta genéticamente modificada sintetiza un almidón modificado en comparación con las correspondientes plantas salvajes que no han sido modificadas genéticamente.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el almidón modificado se caracteriza porque tiene una mayor concentración de fosfato covalentemente unido al almidón.

14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 ó 13, en el que el almidón modificado se caracteriza porque tiene una proporción modificada entre el fosfato en C-3 y el fosfato en C-6.

15. Procedimiento para la fabricación de un almidón modificado que incluye la etapa de extraer el almidón de una célula vegetal genéticamente modificada de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5.

16. Procedimiento para la fabricación de un almidón modificado que incluye la etapa de extraer el almidón de una planta genéticamente modificada de acuerdo con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8.

17. Uso de plantas de cuerdo con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8 para la fabricación de un almidón modificado.

18. Procedimiento para la fabricación de harinas que incluye la etapa de molturación de las partes de plantas de las plantas de acuerdo con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8 o de material de reproducción de acuerdo con la reivindicación 9 o material cosechable de acuerdo con la reivindicación 10.

19. Uso de células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 o de plantas de acuerdo con una de las reivindicaciones 6, 7 u 8 para la fabricación de harinas.

20. Molécula de ácido nucleico recombinante que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa y una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa.

21. Vector que contiene una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 20.

22. Vector de acuerdo con la reivindicación 21, en el que las moléculas de ácido nucleico recombinante están unidas a secuencias reguladoras que inician la transcripción en células procariotas o eucariotas.

23. Célula huésped que está genéticamente modificada en cuanto a que contiene al menos una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 20 o un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 ó 22 además de su genoma natural, en el que la célula huésped es una bacteria, una célula fúngica o una célula vegetal.

24. Composición que contiene una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 20 o un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 ó 22.

25. Composición que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína [P-glucan]-hidro-discinasa y una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína [alfa-1,4-glucan]-hidro-discinasa.

26. Uso de una composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 24 ó 25 para la transformación de células vegetales.