PEPTIDO APTAMERO PARA NEUTRALIZAR LA UNION DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS A ANTIGENOS PLAQUETARIOS Y APLICACIONES TERAPEUTICAS Y DE DIAGNOSTICO QUE LO CONTIENEN.

Péptido aptámero que comprende:

A.al menos un dodecapéptido que tiene en la dirección N-terminal a C-terminal una secuencia de:

i.cuatro aminoácidos alifáticos seleccionados de entre el grupo consistente en valina, isoleucina, leucina, alanina y glicina,

ii.dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo consistente en ácido aspártico y ácido glutámico,

iii.una prolina,

iv.un aminoácido básico seleccionado de entre el grupo consistente en arginina y lisina,

v.dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo consistente en ácido aspártico y ácido glutámico,

vi.un alcohol aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en treonina y serina, y

vii.un aminoácido aromático seleccionado de entre el grupo consistente en triptófano, tirosina y fenilalanina;

B.al menos un polipéptido, y opcionalmente

C.uno o más marcador(es) detectable(s)

Péptido aptámero para neutralizar la unión de anticuerpos específicos a antígenos plaquetarios y aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico que lo contienen.

La presente invención se refiere a un péptido aptámero que reproduce en particular el epítopo del antígeno plaquetario humano HPA-1a presente en las moléculas GPIIb/IIIa plaquetarias y que es capaz de neutralizar la unión de anticuerpos específicos del HPA-1a (anti-HPA-1a). Este péptido aptámero se utiliza ventajosamente en un método para detectar e identificar anticuerpos específicos de HPA-1a en suero humano, en un kit de diagnóstico para explorar e identificar anticuerpos, en un inmunoensayo y en una composición farmacéutica.

Las plaquetas son uno de los componentes principales de la sangre humana y son los componentes celulares del sistema de coagulación sanguínea. La sangre está compuesta básicamente de plasma, glóbulos rojos (eritrocitos), glóbulos blancos (leucocitos) y plaquetas (trombocitos). Las plaquetas se producen en la médula ósea por los megacariocitos. Se entiende comúnmente que las plaquetas no son realmente verdaderas células, sino que son fragmentos de membrana y citoplasma que contienen gránulos. De forma más específica, las plaquetas comprenden una membrana exterior y el citoplasma procedente de megacariocitos, que a su vez contienen gránulos, cuerpos densos, un sistema tubular denso y mitocondrias.

Además de las glicoproteínas plaquetarias GPIIb/IIIa, GPIa/IX, GPIa/IIa o GPIV, las plaquetas contienen al menos cinco glicoproteínas que están ligadas por anclajes glicosil fosfatidil inositol (GPI). Entre ellos se encuentra una glicoproteína de 170 kDa clasificada como CD109. CD 109 se caracteriza por portar, entre otros, el aloantígeno Gov.

La trombocitopenia inmune es un estado clínico en el que las plaquetas son destruidas por anticuerpos. La púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) es un trastorno común caracterizado por la destrucción plaquetaria autoinmune causada por los autoanticuerpos antiplaquetarios IgG, que se dirigen contra las glicoproteínas plaquetarias GPIIb/IIIa, GPIa/IX, GPIa/IIa o GPIV. La trombocitopenia fetal/neonatal aloinmune (NAIT) se debe a los aloanticuerpos (anti-HPA) contra el aloantígeno plaquetario materno humano (HPA) que destruyen las plaquetas fetales, provocando una trombocitopenia grave. La NAIT tiene una incidencia estimada de 1/1.000 embarazos y causa derrames cerebrales en el útero o ventriculomegalia. La exploración y la identificación de aloanticuerpos es un paso obligatorio para prevenir y curar esta enfermedad. La púrpura post-transfusión (PTP) es otra destrucción plaquetaria inmunomediada debida a los aloanticuerpos anti-HPA. La refractariedad plaquetaria es una situación clínica en la que las plaquetas transfundidas son destruidas por aloanticuerpos producidos por el receptor. La caracterización de estos anticuerpos es un paso necesario para proporcionar una transfusión de plaquetas eficaz.

Hasta ahora, todos los métodos para detectar auto- o alo-anticuerpos dirigidos a plaquetas utilizan plaquetas frescas en ensayos de inmunoblotting, inmunoprecipitación, inmunocaptura, inmunofluorescencia plaquetaria o inmovilización con anticuerpos monoclonales de antígenos plaquetarios, tales como el ensayo de inmovilización con anticuerpos monoclonales plaquetario (MAIPA) o el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Todos estos ensayos requieren previamente una colección de plaquetas tipificadas en los sistemas HPA. Además, estos ensayos conocidos en la técnica utilizan plaquetas frescas, tal como se ha señalado anteriormente. Sin embargo, durante su conservación a 4ºC o -20ºC, las glicoproteínas plaquetarias experimentan un proceso de desprendimiento, de forma que la preparación plaquetaria es inapropiada para detectar ciertos anticuerpos plaquetarios. Todos los intentos para mantener un nivel normal de expresión de las glicoproteínas plaquetarias durante un período más largo de tiempo, tal como más de una semana, no han tenido éxito. Debido a estos hechos, es necesario reunir un nuevo lote de plaquetas de los donantes cada semana. Por tanto, existe la necesidad constante en el campo de la inmunología plaquetaria de un método para mantener un nivel normal de expresión de glicoproteínas plaquetarias durante un largo período de tiempo (por ejemplo, más de un mes).

La WO9411740 describe fragmentos de HPA-1a, GPIIb/IIIa y su utilización en la detección de anticuerpos específicos de HPA-1a.

Por tanto, el problema técnico subyacente en la presente invención consiste en proporcionar un nuevo sistema que permita la detección y/o identificación de anticuerpos específicos del antígeno plaquetario humano en suero humano. En particular, la presente invención debe proporcionar (i) un aptámero que conserve la expresión de su epítopo de los aloantígenos plaquetarios presentes en las glicoproteínas plaquetarias -es decir el nivel normal y preferentemente también el modelo normal- de forma estable bajo almacenamiento, (ii) un proceso para producir dichos aptámeros estables, y (iii) aplicaciones analíticas, especialmente inmunológicas, de dichos aptámeros estables.

La solución al problema técnico anterior se consigue por medio de las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

En particular, se proporciona un péptido aptámero que comprende:

El término "péptido aptámero" tal como se emplea aquí también incluye todo compuesto tal como se ha definido más arriba, donde el dodecapéptido funciona como un hapteno. Además, el péptido aptámero de acuerdo con la presente invención es capaz de reproducir un epítopo de HPA-1a presente en las glicoproteínas plaquetarias GPIIb/IIIa.

De acuerdo con la presente invención, el término "dodecapéptido" incluye cualquier dodecapéptido que tenga una secuencia de aminoácidos tal como se ha definido anteriormente o como se explica en las Figuras 1a y 1b. En particular, el dodecapéptido puede estar unido a uno o más polipéptidos por cualquier modo de unión, por ejemplo enlace(s) covalente(s), puente de hidrógeno, enlaces de van-der-Waals o electrostático(s). En una realización preferente de la presente invención, el dodecapéptido está enlazado al polipéptido de forma covalente.

En una realización de la presente invención, el péptido aptámero tal como se ha definido anteriormente comprende un dodecapéptido que tiene la secuencia VVAGDDPREDTW (SEQ ID NO:1).

Además, aquí, el término "polipéptido" no es limitativo con respecto a la longitud o el tipo de secuencia, sino que incluye cualquier secuencia de aminoácidos, tal como secuencias de proteínas andamio o proteínas de fusión. De acuerdo con la presente invención, dicho(s) polipéptido(s) se puede(n) utilizar también en la presente invención en forma de sus fragmentos y puede(n) contener cualquier residuo procedente de su preparación, tales como las etiquetas empleadas para la detección o en cualquier etapa de purificación. El(los) polipéptido(s) de acuerdo con la presente invención también incluye(n) dicho(s) polipéptido(s) con alteraciones procedentes del contacto con un...

1. Péptido aptámero que comprende:

2. Péptido aptámero según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia del dodecapéptido es según la SEQ ID NO:1.

3. Péptido aptámero según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el polipéptido se selecciona de entre el grupo consistente en tiorredoxina (Trx), proteína fluorescente verde (GFP), nucleasa de estafilococo, polipéptidos de espiral enrollada, polipéptidos que contienen cisteína capaces de formar puentes disulfuro o uno o más fragmentos de los mismos.

4. Péptido aptámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el marcador detectable se selecciona de entre el grupo consistente en un marcador fluorescente, un marcador radioactivo, His-tag, glutatión-transferasa (GST), Flag-tag, biotina, Ha-tag, Myc-tag y XPress-tag.

5. Ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido aptámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Método para detectar o identificar anticuerpos específicos del antígeno plaquetario humano, que comprende las etapas de:

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa de detección (iii) comprende uno o más méto- do(s) de detección seleccionado(s) de entre el grupo consistente en Inmunoblotting, inmunoprecipitación, inmunocaptura, inmovilización con anticuerpos monoclonales de antígenos plaquetarios, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), citometría de flujo, tecnología de arrays de proteínas, espectroscopía, espectrometría de masas, cromatografía, resonancia plasmónica superficial, extinción de fluorescencia y transferencia de energía de fluorescencia.

8. Método según la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque el anticuerpo específico del antígeno plaquetario humano que se debe detectar o identificar es anti-HPA-1a.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para detectar y/o identificar anticuerpos específicos del antígeno plaquetario humano en el suero de un paciente que padece de una forma de trombocitopenia inmune.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque la trombocitopenia inmune se selecciona de entre el grupo consistente en púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), trombocitopenia fetal/neonatal aloinmune (NAIT), púrpura post-transfusión (PTP) o refractariedad plaquetaria.

11. Kit de diagnóstico para explorar y/o identificar anticuerpos específicos del antígeno plaquetario humano, que comprende el péptido aptámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Inmunoensayo para la detección de anticuerpos específicos del antígeno plaquetario humano en suero humano, que comprende la utilización del péptido aptámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido aptámero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y opcionalmente uno o más componentes adicionales seleccionados de entre el grupo consistente en un soporte farmacéuticamente aceptable, sales farmacéuticamente aceptables, agentes auxiliares, diluyentes y disolventes, o cualquier combinación de los mismos.