La invención describe un nuevo marcador de selección termoestable para la manipulación genética de bacterias del género Thermus spp.

, en particular, con un polinucleótido que, cuando se expresa, la proteína resultante proporciona a las bacterias del género Thermus spp. un fenotipo dependiente de estreptomicina, lo que tiene distintas aplicaciones en el campo de la biotecnología como marcador de selección de clonaje y expresión de genes de interés o en la deleción específica de genes

Nuevo marcador de selección termoestable para la manipulación genética de Thermus spp.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con marcadores de selección termoestable para la manipulación genética de bacterias del género Thermus spp., en particular, con un polinucleótido que, cuando se expresa, la proteína resultante proporciona a las bacterias del género Thermus spp. un fenotipo dependiente de estreptomicina, lo que tiene distintas aplicaciones en el campo de la biotecnología como marcador de selección de clonaje y expresión de genes de interés o en la deleción específica de genes.

Antecedentes de la invención

La producción de proteínas de interés biotecnológico a escala industrial suele llevarse a cabo mediante el clonado del gen que codifica dicha proteína en bacterias o levaduras modelos fácilmente manipulables (e.g., Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae). Sin embargo, cuando se trata de proteínas procedentes de bacterias termófilas, como las procedentes del género Thermus spp., que poseen una complejidad en su estructura muy particular, dichos sistemas modelo no son eficaces, lo que hace necesario emplear al propio organismo termófilo del que procede la proteína como factoría celular. Lamentablemente, las estrategias empleadas actualmente para la expresión de proteínas de interés en organismos termófilos (e.g. Thermus spp.), dependen exclusivamente de vectores que confieren resistencia a kanamicina lo que impide la producción de proteínas en cepas que posean dicha resistencia de forma natural.

Las bacterias del género Thermus spp. se caracterizan por su capacidad para crecer a altas temperaturas y por su facilidad de manipulación genética, única entre organismos termófilos extremos. Por otro lado, constituyen una fuente enormemente amplia de enzimas termoestables, tanto de aplicación industrial, tal como lipasas, catalanas, pululasas y proteasas, como de aplicación en técnicas de biología molecular, como las ADN polimerasas.

La producción de enzimas de interés biotecnológico procedentes de microorganismos termófilos extremos, suele efectuarse mediante su clonado y expresión a alto nivel en una bacteria o levadura modelo fácilmente manipulable, tal como E. coli o S. cerevisiae. Sin embargo, existen una gran cantidad de enzimas termófilas cuya complejidad de síntesis hace imposible su obtención en forma activa en estos organismos modelo (Hidalgo, A. y cols., 2004. Thermus thermophilus as a cell factory for the production of a thermophilic Mn-dependent catalase which fails to be synthesized in an active form in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 70 (7): 3839-3844). Este es el caso frecuente de enzimas hetero-oligoméricas o el de aquellas enzimas que requieren la incorporación de un cofactor en el proceso de síntesis, que suele requerir la ayuda de chaperonas específicas que mantienen la estructura de la enzima en posición abierta para la entrada del mencionado cofactor. En tales casos, que pueden llegar a constituir hasta el 50% de las enzimas codificadas en cualquier termófilo, la alternativa evidente es la de utilizar en la producción un microorganismo termófilo relacionado evolutivamente con aquel del que procede la enzima de interés.

Actualmente, existen vectores o plásmidos seleccionables para el clonaje y la expresión de enzimas en cepas del género Thermus spp. Tales plásmidos se basan en los siguientes sistemas de selección:

a) Gen termoestable de resistencia a kanamicina

(Liao, H. y cols., 1986. Isolation of a thermostable enzyme variant by cloning and selection in a thermophile. Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 83: 576-580). A partir de este gen, se han desarrollado una serie de vectores para Thermus spp., descritos esencialmente en los siguientes artículos:

- Lasa y cols., 1992. Development of Thermus thermophilus. Escherichia shuttle vectors and their use for the expression of the Clostridium thermocellum celA gene in Thermus thermophilus. Journal of Bacteriology. Vol. 174:6424-6431. En este artículo se describe la autoselección de orígenes de replicación crípticos de cepas de Thermus spp. mediante la incorporación del gen quimérico de resistencia termoestable a kanamicina, desarrollado en el artículo publicado por el mismo grupo en la revista Molecular Microbiology. Vol. 6:1555-1564 (1992) titulado "Insertional mutagenesis in the extreme thermophilic eubacteria Thermus thermophilus", y descrito en la patente española número P9301522.

- Mather y Fee. 1992. Development of plasmid cloning vectors for Thermus thermophilus HB8: Expression of a heterologous, plasmid-borne kanamycin nucleotidyl transferase gene. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 58:421-425. Los autores emplean el gen de resistencia termoestable a kanamicina descrito por Liao y colaboradores en 1986 (citado supra) para generar por inserción al azar un plásmido con el origen del replicación de pTT8.

- De Grado y cols., 1999. A high-transformation-efficiency cloning vector for Thermus thermophilus. Plasmid. Vol. 42:241-245. Los autores describen un vector derivado del publicado por Lasa y cols. en 1992 (citado at supra) en el que se ha definido y recortado el origen de replicación mínimo necesario para su mantenimiento en Thermus spp., y se ha integrado en el vector pUC18 junto con el gen quimérico que confiere resistencia termoestable a kanamicina (P9301522). Este vector ha sido empleado en trabajos posteriores para la expresión de proteínas y de ARN.

- Moreno y cols., 2003. Development of a gene expression vector for Thermus thermophilus based on the promoter of the respiratory nitrate reductase. Plasmid. Vol: 49:2-8. En este artículo se describe el desarrollo de un vector derivado del descrito en de Grado y cols (1999) (citado at supra) al que se le incorporó un promotor inducible en cepas capaces de respirar nitrato, mostrándose su actividad con dos genes testigo.

b) Otras resistencias termoestables a antibióticos

- Brouns y cols., 2005. Engineering a selectable marker for hyperthermophiles. Journal of Biological Chemistry. Vol. 280:11422-11431. Los autores describen en dicho artículo un nuevo sistema de selección para Thermus thermophilus basado en una forma termoestable de una proteína de resistencia al antibiótico bleomicina, donada en un vector derivado del de de Grado y cols. 1999 (citado at supra).

- Nakamura y cols., 2005. In vivo directed evolution for thermostabilization of Escherichia coli hygromycin B phosphotransferase and the use of the gene as a selection marker in the host-vector system of Thermus thermophilus. J Biosci Bioeng. Vol. 100:158-63. En este trabajo se desarrolla por evolución dirigida una versión termoestable de la proteína de resistencia a hygromicina de E. coli, capaz de conferir resistencia a este antibiótico en Thermus thermophilus hasta 67ºC, y lo emplean para el desarrollo de nuevos vectores replicativos.

c) Genes capaces de complementar auxotrofias en mutantes específicos

- Koyama y cols., 1990. A plasmid vector for an extreme thermophile, Thermus thermophilus. FEMS Microbiology Letters. Vol. 72:97-102. En este artículo los autores combinan un plásmido críptico con los genes trpBA, seleccionable en una cepa auxotrófica para triptófano, aunque presenta una alta frecuencia de recombinación con el cromo- soma.

- Kayser y Kilbane., 2001. New host-vector system for Thermus spp. based on the malate dehydrogenase gene. Journal of Bacteriology. Vol. 183:1792-5. En este artículo se propone la utilización del gen de la enzima malato deshidrogenasa como sistema de selección de plásmidos en cepas defectivas en esta enzima. Este trabajo se continuó con la publicación por Kayser y cols. (2001) del artículo titulado "inducible and constitutive expression using new plasmid and integrative expression vectors for Thermus spp" en Lett Appl Microbiol. Vol. 32:412-8, en el que se muestra el empleo de este sistema de selección para el desarrollo de vectores con una cierta capacidad de expresión en Thermus spp. Más recientemente, los mismos autores han extendido el número de enzimas expresables en Thermus spp. en el artículo de Park y cols. de 2004 titulado "Heterologous gene expression in Thermus thermophilus: beta-galactosidase, dibenzothiophene monooxygenase, PNB carboxy esterase, 2-aminobiphenyl-2,3-diol...

1. Un polinucleótido aislado constituido por la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 1, o una proteína funcionalmente equivalente.

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, cuya secuencia de nucleótidos está constituida por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.

3. Un ácido nucleico que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2.

4. Una construcción génica que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 3.

5. Construcción según la reivindicación 4, donde dicha construcción génica comprende, además, un marcador de selección.

6. Construcción según la reivindicación 5, donde dicho marcador de selección es un gen de resistencia.

7. Construcción según la reivindicación 6, donde dicho gen de resistencia es el gen quimérico de resistencia termoestable a kanamicina.

8. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, donde dicha construcción comprende, además, un origen de replicación en Thermus spp.

9. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, un ácido nucleico según la reivindicación 3 o una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8.

10. Una bacteria del género Thermus spp. que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, un ácido nucleico según la reivindicación 3, una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o un vector según la reivindicación 9.

11. Bacteria según la reivindicación 10, en donde dicha bacteria del género Thermus spp. se selecciona entre T. brockianus, T. scotoductus, T. filiformis y T. oshimai, preferentemente, T. thermophilus y T. aquaticus.

12. Una composición que comprende bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11.

13. Empleo de un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, un ácido nucleico según la reivindicación 3, una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, como marcador de selección termoestable.

14. Empleo de un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, un ácido nucleico según la reivindicación 3, una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o un vector según la reivindicación 9, para proporcionar un fenotipo estreptomicina dependiente a una bacteria termófila del género Thermus spp.

15. Empleo de un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, un ácido nucleico según la reivindicación 3, una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, para el diseño de un plásmido termoestable para expresar un gen de interés en una bacteria termófila del género Thermus spp.

16. Empleo según la reivindicación 15, en donde dicho plásmido es integrativo o replicativo.

17. Empleo de un vector según la reivindicación 9, para obtener un mutante de deleción dirigida de un gen específico en una bacteria termófila del género Thermus spp.

18. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde dicha bacteria termófila del género Thermus spp. pertenece a las especies T. thermophilus, T. aquaticus, T. brockianus, T. scotoductus, T. filifbrmis y T. oshimai.

19. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, donde el gen de interés codifica una proteína, preferentemente, una enzima.

20. Un método para producir una proteína de interés en bacterias termófilas del género Thermus spp. que comprende

21. Un método para obtener un mutante de deleción dirigida de un gen específico en una bacteria termófila del género Thermus spp. que comprende

22. Una proteína aislada constituida por la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 o una proteína funcionalmente equivalente de la misma.