NUEVO GEN SMS37.

Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:

2;

(b) polinucleótidos que comprenden la secuencia nucleotídica según SEQ ID NO:1;

(c) polinucleótidos que son al menos 70% idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (b), y que codifican un exportador de azúcar y/o un exportador de alcohol de azúcar,

o la hebra complementaria de tal polinucleótido

Nuevo gen SMS 37.

La presente invención se refiere a genes recientemente identificados que codifican proteínas que están implicadas en la síntesis de ácido L-ascórbico (en lo sucesivo también denominado como vitamina C). La invención también se refiere a polinucleótidos que comprenden las secuencias polinucleotídicas de longitud completa de los nuevos genes y sus fragmentos, a los nuevos polipéptidos codificados por los polinucleótidos y sus fragmentos, así como a sus equivalentes funcionales. La presente invención también se refiere al uso de dichos polinucleótidos y polipéptidos como herramientas biotecnológicas en la producción de vitamina C a partir de microorganismos, con lo que una modificación de dichos polinucleótidos y/o polipéptidos codificados tiene un impacto directo o indirecto en el rendimiento, producción y/o eficiencia de producción del producto de fermentación en dicho organismo. También se incluyen métodos/procedimientos para usar los polinucleótidos y las secuencias polinucleotídicas modificadas para transformar microorganismos hospedantes. La invención también se refiere a microorganismos manipulados mediante ingeniería genética, y a su uso para la producción directa de vitamina C.

La vitamina C es uno de los factores nutrientes muy importantes e indispensables para seres humanos. La vitamina C también se usa en alimentación animal incluso aunque algunos animales de granja pueden sintetizarla en su propio organismo.

Durante los 70 años pasados, la vitamina C se ha producido industrialmente a partir de D-glucosa mediante el método bien conocido de Reichstein. Todas las etapas en el proceso son químicas excepto una (la conversión de D-sorbitol en L-sorbosa), que se lleva a cabo mediante conversión microbiana. Desde su implementación inicial para la producción industrial de vitamina C, se han usado varias modificaciones químicas y técnicas para mejorar la eficiencia del método de Reichstein. Los recientes desarrollos de la producción de vitamina C se resumen en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5ª Edición, Vol. A27 (1996), p. 547ff.

Se han llevado a cabo diferentes etapas intermedias de producción de vitamina C con la ayuda de microorganismos o enzimas aisladas de ellos. De este modo, el ácido 2-ceto-L-gulónico (2-KGA), un compuesto intermedio que se puede convertir químicamente en vitamina C por medio de una reacción de transposición alcalina, se puede producir mediante un proceso de fermentación partiendo de L-sorbosa o D-sorbitol, por medio de cepas que pertenecen, por ejemplo, a los géneros Ketogulonicigenium o Gluconobacter, o mediante un proceso de fermentación alternativa partiendo de D-glucosa, por medio de cepas recombinantes que pertenecen a los géneros Gluconobacter o Pantoea.

Los métodos actuales de producción químicos para la vitamina C tienen algunas características indeseables tales como el consumo de gran cantidad de energía y el uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos e inorgánicos. Por lo tanto, durante las pasadas décadas, se han investigado otros enfoques para fabricar vitamina C usando conversiones microbianas, que fuesen más económicos así como ecológicos.

La producción directa de vitamina C a partir de un número de sustratos, incluyendo D-sorbitol, L-sorbosa y L-sorbosona, se ha dado a conocer en varios microorganismos, tales como algas, levaduras y bacterias de ácido acético, usando diferentes métodos de cultivo. Los ejemplos de bacterias conocidas capaces de producir directamente vitamina C incluyen, por ejemplo, las cepas de los géneros de Gluconobacter, Gluconacetobacter, Acetobacter, Ketogulonicigenium, Pantoea, Pseudomonas o Escherichia. Los ejemplos de algas o levaduras conocidas incluyen, por ejemplo, Candida, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces or Chlorella.

El documento WO 2004/029235 A2 describe un gen que codifica una denominada aldehidodeshidrogenasa que está implicada en la conversión directa de L-sorbosona en vitamina C. Dicho gen se ha aislado de Ketogulonicigenium vulgare DSM 4025 (conocido antiguamente como Gluconobacter oxydans DSM 4025). La producción de vitamina C se podría potenciar con la expresión de dicho gen en cepas mutantes en las que el gen natural se ha destruido.

Los microorganismos capaces de asimilar D-sorbitol para el crecimiento poseen habitualmente enzimas capaces de oxidar este compuesto en un sustrato de asimilación universal tal como D-fructosa. También, los microorganismos capaces de crecer en L-sorbosa poseen una enzima, la L-sorbosa reductasa dependiente de NAD(P)H, que es capaz de reducir este compuesto a D-sorbitol, que entonces se oxida posteriormente a D-fructosa. La D-fructosa es un excelente sustrato para el crecimiento de muchos microorganismos, después de que se ha fosforilado por medio de una D-fructosa cinasa.

Por ejemplo, en el caso de bacterias de ácido acético, que son microorganismos gramnegativos, aerobios forzados que pertenecen al género Acetobacter, Gluconobacter, y Gluconacetobacter, estos microorganismos son capaces de transportar D-sorbitol al citosol y convertirlo en D-fructosa por medio de una D-sorbitol deshidrogenasa citosólica dependiente de NAD. Algunas cepas individuales, tales como Gluconobacter oxydans IFO 3292, e IFO 3293, son capaces igualmente de transportar L-sorbosa al citosol y reducirla a D-sorbitol por medio de una L-sorbosa reductasa citosólica dependiente de NAD(P)H, que entonces se oxida posteriormente a D-fructosa. En estas bacterias, la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas, así como el ciclo del ácido tricarboxílico, no están completamente activos, y la ruta principal que canaliza azúcares al metabolismo central es la ruta de las pentosas fosfato. La D-fructosa-6-fosfato, obtenida a partir de D-fructosa mediante una reacción de fosforilación, entra en la ruta de las pentosas fosfato, metabolizándose posteriormente y produciendo un poder reductor en forma de NAD(P)H y compuestos tricarboxílicos necesarios para el crecimiento y mantenimiento.

Las bacterias de ácido acético son bien conocidas por su capacidad para oxidar de forma incompleta diferentes sustratos tales como alcoholes, azúcares, alcoholes de azúcares, y aldehídos. Estos procedimientos son generalmente conocidos como fermentaciones oxidativas u oxidaciones incompletas, y están bien consolidados desde hace mucho tiempo en la industria alimentaria y química, especialmente en la producción de vinagre y en la producción de L-sorbosa. Un producto útil que se sabe que se obtiene a partir de oxidaciones incompletas de D-sorbitol o L-sorbosa usando cepas que pertenecen al género Gluconobacter es 2-KGA.

Las bacterias de ácido acético logran estas reacciones de oxidación completa por medio de diferentes deshidrogenasas localizadas en el espacio periplásmico, en la membrana periplásmica así como en el citoplasma. Se emplean diferentes cofactores mediante las diferentes deshidrogenasas, siendo el más habitual PQQ y FAD para enzimas unidas a membrana o periplásmicas, y NAD/NADP para enzimas citoplásmicas.

Aunque todos los productos de estas reacciones de oxidación se difunden nuevamente al entorno acuoso externo a través de la membrana exterior, algunos de ellos pueden ser transportados pasiva o activamente a la célula se pueden usar posteriormente en rutas metabólicas responsables del crecimiento y formación de energía. Dentro de la célula, los productos oxidados se pueden reducir nuevamente muchas veces a su sustrato original por medio de reductasas, y después se pueden canalizar nuevamente al metabolismo central.

Las proteínas, en particular enzimas y transportadores, que son activas en la metabolización de D-sorbitol o L-sorbosa, se citan aquí como implicadas en el Sistema de Metabolización de Sorbitol/Sorbosa. Tales proteínas se abrevian aquí como proteínas del SMS, y funcionan en la metabolización directa de D-sorbitol o L-sorbosa.

La metabolización de D-sorbitol o L-sorbosa incluye por un lado la asimilación de estos compuestos en el citosol y la conversión posterior en metabolitos útiles para las rutas de asimilación tales como la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas, la ruta de las pentosas fosfato, la ruta de Entner-Doudoroff, y el ciclo del ácido tricarboxílico, todos ellos implicados en todas las reacciones vitales formadoras de energía y anabólicas necesarias para el crecimiento y mantenimiento de las células vivas. Por otro lado, la metabolización de D-sorbitol o L-sorbosa también incluye la conversión de...

1. Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2;

(b) polinucleótidos que comprenden la secuencia nucleotídica según SEQ ID NO:1;

(c) polinucleótidos que son al menos 70% idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (b), y que codifican un exportador de azúcar y/o un exportador de alcohol de azúcar,

o la hebra complementaria de tal polinucleótido.

2. Un vector que contiene el polinucleótido según la reivindicación 1.

3. El vector de la reivindicación 2, en el que el polinucleótido está enlazado operativamente a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células hospedantes procariotas o eucariotas.

4. Un microorganismo que comprende el vector de la reivindicación 2 ó 3.

5. Un microorganismo según la reivindicación 4, capaz de producir directamente vitamina C a partir de D-sorbitol en cantidades de 300 mg/l o más cuando se mide en un método de células en reposo tras un período de incubación de 20 horas.

6. Un microorganismo según la reivindicación 5, capaz de producir directamente vitamina C a partir de L-sorbosa en cantidades de 800 mg/l o más.

7. Un polipéptido codificado por un polinucleótido según la reivindicación 1.

8. Procedimiento para producir células capaces de expresar un polipéptido según la reivindicación 7, que comprende la etapa de manipular mediante ingeniería genética células con el vector de la reivindicación 2 ó 3, o con un polinucleótido según la reivindicación 1.

9. Uso de un polinucleótido según la reivindicación 1, o un vector según las reivindicaciones 2 ó 3, para la producción de vitamina C.

10. Un microorganismo según la reivindicación 4, o un microorganismo que contiene un gen endógeno que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 que está sobreexpresado, siendo capaz dicho microorganismo de aumentar la producción de vitamina C al menos 5% en comparación con un microorganismo de tipo natural.

11. Un microorganismo según la reivindicación 10, que produce un polipéptido según la reivindicación 7 con una actividad aumentada y/o mejorada de exportador de azúcar y/o exportador de alcohol de azúcar.

12. Un microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 ó 10 a 11, seleccionado del grupo que consiste en Pseudomonas, Pantoea, Escherichia, Ketogulonicigenium, y bacterias de ácido acético como, por ejemplo, Gluconobacter, Acetobacter o Gluconacetobacter, preferiblemente Acetobacter sp., Acetobacter aceti, Gluconobacter frateurii, Gluconobacter cerinus, Gluconobacter thailandicus, Gluconobacter oxydans, preferiblemente Gluconobacter oxydans, más preferiblemente Gluconobacter oxydans DSM 17078.

13. Procedimiento para la producción de un gen potenciado exportador de azúcar y/o exportador de alcohol de azúcar en un microorganismo, comprendiendo dicho microorganismo un polinucleótido según la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de sobreexpresar dicho polinucleótido que conduce a una producción aumentada de vitamina C de al menos 5% en comparación con el microorganismo de tipo natural.

14. Procedimiento para la producción de un microorganismo que produce al menos 5% más de vitamina C que un microorganismo de tipo natural, conteniendo dicho microorganismo un gen que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende la etapa de alterar dicho microorganismo de forma que el gen esté sobreexpresado.

15. Procedimiento para la producción de vitamina C con un microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 o reivindicaciones 4 a 6, en el que dicho microorganismo se incuba en un medio acuoso en condiciones que permiten la producción directa de vitamina C a partir de D-sorbitol o L-sorbosa, y en el que opcionalmente la vitamina C se aísla como el producto de fermentación.