Un ensayo para cribar compuestos de ensayo para identificar agentes que inhiben el crecimiento de células hiperproliferativas que responden a PPAR?,

que comprende:

(a) formar una mezcla de reacción que incluye:

(i) una proteína PPAR?, y

(ii) un compuesto de ensayo; y

(b) detectar la interacción de la proteína PPAR? con el compuesto de ensayo,

(c) poner en contacto los compuestos de ensayo de la etapa (b) que se unen específicamente a la proteína PPAR? con una célula hiperproliferativa que responde a PPAR?; e

(d) identificar agentes de la etapa (c) que inhiben el crecimiento de la célula transformada

Métodos y composiciones farmacéuticas para inhibir el crecimiento de células tumorales.

Antecedentes de la invención

Los adipocitos son células altamente especializadas que desempeñan un papel crítico en energía y homeostasis. Su papel principal es almacenar triglicéridos en los momentos de exceso calórico y movilizar esta reserva durante los periodos de privación nutricional. Los adipocitos derivan de una célula madre multipotente de origen mesodérmico que también da lugar a los linajes musculares y de cartílago. La diferenciación de los adipocitos se caracteriza por un incremento coordinado de la expresión génica específica de los adipocitos.

En los últimos años se ha visto avances importantes en nuestro conocimiento de las bases moleculares de la diferenciación de los adipocitos. (revisado en Cornelius, P. et al. (1994) Annu. Rev. Nutr. 14:99-129; Tontonoz, P. et al. (1995) Curr. Opin. Genet. Dev. 5:571-576. En la diferenciación de las células adiposas se inducen varios factores de transcripción (C/EBPa, C/EBPß y ADD1/SREBP1) e influyen en este proceso hasta cierto punto (Freytag, S.O. et al. (1994) Genes Dev. 8:1654-63; Kim, J.B. y Spiegelman, B.M. (1996) Genes Dev. 10:1096-1107; Lin, F.T. y Lane, M.D. (1994) PNAS USA 91:8757-61; Samuelsson, L. et al. (1991) EMBO J. 10:3787-93; Tontonoz, P. et al. (1993) Mol Cell Biol 13:4753-9; Umek, R.M. et al. (1991) Science 251:288-92; Wu, C.L. et al. (1995) Mol Cell Biol 15:253646; Yeh, W.C. et al. (1995) Genes Dev. 9:168-81).

Los receptores activados por el proliferador de peroxisomas, o "PPAR", son miembros de la clase tipo II de la superfamilia de receptores esteroides/tiroideos y median los efectos pleyotrópicos de los proliferadores de peroxisomas. La clase tipo II de receptores nucleares incluye PPAR, el receptor de la hormona tiroidea (T₃R) y el receptor de la vitamina D₃ (VD₃R). Los receptores de tipo II son funcionalmente distintos de los receptores clásicos de esteroides, tales como el receptor de glucocorticoides, el receptor de progesterona y el receptor de estrógeno (revisado en Stunnenberg, H.G. (1993) BioEssays Vol. 15 (5): 309-15). Tres propiedades distinguen estas dos clases. En primer lugar, los receptores de tipo II son capaces de unirse a sus elementos de respuesta en ausencia del ligando (Damm et al. (1989) Nature 339:593-597; Sap et al. Nature 340:242-244; De The et al. (1990) Nature 343:177-180), mientras que la unión al ligando se requiere para disociar el complejo receptor tipo I-hsp 90 y, por lo tanto, dirige indirectamente la unión al ADN. En segundo lugar, los receptores de tipo II se unen y transactivan mediante elementos de respuesta que están compuestos por medios sitios organizados como repeticiones directas, a diferencia de los medios sitios organizados de forma palindrómica separados invariablemente por tres nucleótidos requeridos por los receptores de tipo I. Finalmente, los receptores de tipo II no se unen a sus sitios respectivos de unión como homodímeros sino que requieren un factor auxiliar, RXR (p. ej., RXRa, RXRß, RXR?) para una unión de alta afinidad (Yu et al. (1991) Cell 67:1251-1266; Bugge et al. (1992) EMBO J. 11:1409-1418; Kliewer et al. (1992) Nature 355:446-449; Leid et al. (1992) Cell 68:377-395; Marks et al. (1992) EMBO J. 11:1419-1435; Zhang et al. (1992) Nature 355:441-446). La interacción entre los receptores de tipo II requiere una región en el dominio C-terminal (Yu et al. (1991) Cell 67:1251-1266; Kliewer et al. (1992) Nature 355:446-449; Leid et al. (1992) Cell 68:377-395; Marks et al. (1992) EMBO J. 11:1419-1435). Después de la unión, la actividad transcripcional de un gen diana (es decir, un gen asociado con la secuencia de ADN específica) se incrementa como función del ligando unido al heterodímero receptor.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la activación de PPAR? desempeña un papel clave en la inducción de la parada del crecimiento por diferenciación terminal de células que expresan PPAR? que proliferan activamente, particularmente las células precursoras de adipocitos transformadas.

El objeto de la invención se define en las reivindicaciones.

Descripción detallada de los dibujos

La Figura 1 es un panel de fotografías que muestran los efectos de pioglitazona en la estimulación de la parada del crecimiento y en la diferenciación adiposa de células NIH-3T3 que expresan ectópicamente PPAR? (NIH-PPAR?) comparado con células control infectadas con el vector vacío (NIH-vector). La flecha muestra un adipocito diferenciado que contiene gotas de lípido en el citoplasma.

Las Figuras 2A, 2B y 2C muestran gráficos que representan el crecimiento de células NIH-PPAR?, NIH-vector o HIB1B en presencia o ausencia de ligandos de PPAR?. La Figura 2A es un gráfico que representa el crecimiento acumulativo de células no tratadas o tratadas con 5 µM de pioglitazona. La Figura 2B es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de disminución del número de células en las placas tratadas con pioglitazona respecto a las placas no tratadas. La Figura 2C es un gráfico de barras que muestra células en crecimiento exponencial tratadas sin o con dos tiazolidindionas, pioglitazona (5 µM) o BRL49653 (1 µM) durante 5 días.

La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra los efectos de la actividad de factor de transcripción de PPAR? en la función de regulación negativa del crecimiento celular. El panel izquierdo muestra las representaciones esquemáticas de los ADNc de PPAR?1 y 2 de tipo salvaje o PPAR?2 mutante. El panel derecho muestra los efectos del tratamiento con pioglitazona en la proporción de crecimiento de las células que expresan las formas de tipo salvaje o mutantes de PPAR? tratadas con o sin pioglitazona.

La Figura 4 muestra el análisis Northern de ARN preparados a partir de varios tejidos humanos. Como se indica a la izquierda de la figura, la transferencia se hibridó con ADNc de PPAR? y con la proteína de unión aP2 específica de adipocitos.

La Figura 5A muestra el análisis Northern de la expresión del ARN de PPAR? en ARN preparado a partir de varios liposarcomas (SP107, SP144, SP147, SP154, SP158, SP160, SP115, SP155, SP156, SP200, SP204, SP116). Los ARN preparados a partir de tejidos adiposos y musculares se muestran como controles. La transferencia se hibridó con ADNc de PPAR?.

La Figura 5B muestra el análisis Northern de la expresión del ARN de PPAR? en dos liposarcomas (SP155 y SP156) comparado con varios tipos distintos de sarcomas de tejido blando que incluyen histiocitoma fibroso maligno (MFH), leiomiosarcoma, angiosarcoma, tumor maligno de la vaina de nervios periféricos (MPNS) o histiocitoma fibroso maligno (MFH). El ARN preparado a partir de tejido adiposo se muestra como control. La transferencia se hibridó con ADNc de PPAR?.

La Figura 6 es un gráfico que representa las potencias relativas de los compuestos tiazolidindiona en la inducción de la expresión en células CV-1 de un plásmido informador que contiene la secuencia activadora GAL4 en dirección 5' co-expresada con un plásmido de expresión de fusión que tiene el dominio de unión al ADN de GAL4 de levadura unido al dominio de unión al ligando de hPPAR?. El nivel de activación se indica respecto a la concentración de los compuestos tiazolidindiona, BRL 49653 (mostrado con círculos llenos), pioglitazona (mostrado con círculos no llenos) y troglitazona (mostrado con cuadrados llenos).

La Figura 7 es un panel de fotografías que muestra los cultivos primarios de células de liposarcoma cultivadas en ausencia (paneles A, C y E) y en presencia del ligando de PPAR? pioglitazona (paneles B, D y F). Los paneles A y B representan células no tratadas y tratadas, respectivamente; los paneles C y D representan células no tratadas y tratadas, respectivamente; y los paneles E y F representan células no tratadas y tratadas, respectivamente.

La Figura 8 es una análisis Northern que muestra la expresión de marcadores específicos de adipocitos en células NIH no transfectadas (NIH-vector), células NIH que expresan PPAR? a partir de un vector retroviral (NIH-PPAR?) y células de liposarcoma humano (LS 857). Se indican los cultivos no tratados (-) y los cultivos tratados con pioglitazona sólo (pio), el ligando específico RXR, LG 268 o ambos. Como se indica a la izquierda, la transferencia se hibridó con PPAR?, aP2 y adipsina.

La Figura 9 es una fotografía que muestra...

1. Un ensayo para cribar compuestos de ensayo para identificar agentes que inhiben el crecimiento de células hiperproliferativas que responden a PPAR?, que comprende:

(a) formar una mezcla de reacción que incluye:

(i) una proteína PPAR?, y

(ii) un compuesto de ensayo; y

(b) detectar la interacción de la proteína PPAR? con el compuesto de ensayo,

(c) poner en contacto los compuestos de ensayo de la etapa (b) que se unen específicamente a la proteína PPAR? con una célula hiperproliferativa que responde a PPAR?; e

(d) identificar agentes de la etapa (c) que inhiben el crecimiento de la célula transformada.

2. El ensayo de la reivindicación 1, en el que la mezcla de reacción es una mezcla sin células seleccionada del grupo que consiste en lisados de células y preparaciones de proteína purificada.

3. El ensayo de la reivindicación 1, en el que la mezcla de reacción es una célula completa que expresa la proteína PPAR?.

4. El ensayo de la reivindicación 1, en el que las etapas (a) y (b) comprenden:

(i) proporcionar una célula que incluye

a. un polipéptido PPAR?, y

b. una construcción de gen informador que contiene un gen informador unido operativamente a uno o más elementos reguladores de la transcripción que responden al polipéptido PPAR?;

(ii) poner en contacto la célula con un compuesto de ensayo; y

(iii) detectar un efecto, si existe, del compuesto de ensayo en la expresión del gen informador.

5. El ensayo de la reivindicación 1, en el que el ensayo se repite para una biblioteca variada de al menos 100 compuestos de ensayo diferentes.

6. El ensayo de la reivindicación 1, en el que el compuesto de ensayo se selecciona del grupo que consiste en moléculas orgánicas pequeñas y extractos de productos naturales.

7. El ensayo de la reivindicación 1, en el que la célula hiperproliferativa que responde a PPAR? es un adipocito transformado.

8. El ensayo de la reivindicación 1, que comprende además preparar una preparación farmacéutica de uno o más compuestos identificados como inhibidores del crecimiento de células adipocíticas transformadas.