METODOS DE CRIBADO PARA COMPUESTOS QUE MODULAN LA ACTIVIDAD DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEINA G.

Un método para la identificación de moduladores de GPCRs, que comprende los pasos de:

a.transformar una célula hospedadora eucariota con secuencias genéticas que codifican más de un GPCR(s), en donde esta transformación se realiza con un vector de expresión multicistrónico que comprende una unidad de expresión multicistrónica que comprende aguas abajo de un promotor para la expresión en un hospedador eucariota y enlazados funcionalmente al mismo, los cistrones siguientes:

i.GPCR1

ii.GPCR2 y un

iii.marcador de selección

b.cultivar las células hospedadoras transformadas en condiciones suficientes para la expresión funcional de dichos GPCRs,

c.poner en contacto la célula hospedadora cultivada que expresa los GPCRs de una manera funcional con un modulador potencial de los GPCRs seleccionados,

d.medir una respuesta celular seleccionada de la célula hospedadora transformada por exposición al modulador potencial, y

e.seleccionar un identificador, que induce una respuesta específica

Métodos de cribado para compuestos que modulan la actividad de receptores acoplados a proteína G.

La presente invención se refiere a un método de cribado para la identificación de moduladores (tanto agonistas como antagonistas) de GPCRs y los moduladores así identificados. En una realización preferida de la presente invención, estos moduladores pueden ser moduladores del gusto. La presente invención se refiere adicionalmente a sistemas vectores recombinantes para la expresión estable y heteróloga de receptores acoplados a proteína g (GPCRs) heterodímera seleccionados en células hospedadoras eucariotas. Se describe la expresión funcional de GPCRs manipulados genéticamente para la percepción del sabor dulce y de L-aminoácidos y el uso de dichos receptores para identificación de ligandos funcionales.

Los GPCRs representan la mayor familia de receptores de la superficie celular con un número estimado de hasta 1000 genes en el genoma humano caracterizados por una configuración siete-transmembranal como su característica principal. (Bockaert y Pin, 1999; Pierce et al., 2002). Los GPCRs son activados por una multitud de ligandos diferentes, que incluyen péptidos, proteínas, lípidos, moléculas pequeñas, iones e incluso fotones. Los GPCRs activados alteran su conformación permitiendo que la misma catalice el intercambio de guanosina-difosfato (GDP) por guanosina-trifosfato (GTP) en la subunidad a de una proteína G heterotrímera acoplada al GPCR. Las proteínas G heterotrímeras compuestas de una de 18 subunidades a diferentes, una de 5 subunidades ß diferentes y una de 11 subunidades ? diferentes se clasifican usualmente por la naturaleza de su subunidad a y se agrupan generalmente en cuatro clases principales: G_s, que activa adenilil-ciclasa; G_j que inhibe adenilil-ciclasa; G_q que activa fosfolipasa C; y G_12/13 con funciones heterólogas. Además de la señalización dependiente de la subunidad a, las subunidades ß/? pueden funcionar como moléculas señalizadoras por sí mismas. La señalización dependiente de GPCR se hace aún más compleja si se considera que estos receptores pueden existir como complejos homo-oligómeros o hetero-oligómeros. (George et al., 2002; Milligan et al., 2003; Salahpour et al., 2000). Por tanto, no es sorprendente que los GPCRs sean responsables de la regulación de una gran diversidad de procesos fisiológicos diferentes.

Recientemente, el papel de los GPCRs en los sentidos humanos como la vista, el olfato y el gusto ha sido objeto de investigaciones intensificadas. Mientras que la participación del GPCR rodopsina en el sentido de la vista es uno de los ejemplos de señalización de receptores acoplados a proteína G examinados más exhaustivamente en los últimos 30 años (Maeda et al., 2003), el papel de los GPCRs en el olfato y el sabor amargo así como en el sabor dulce se descubrió en los años 1990. (Buck y Axel, 1999; Firestein, 2001; Lindemann 1996b; Lindemann, 2001).

El descubrimiento de la señalización por GPCR en la percepción del sabor está estrechamente unido al descubrimiento de la señalización específica de saborizantes en las células del gusto de los vertebrados. En estudios electrofísicos y bioquímicos se hizo evidente que la señalización derivada de los saborizantes daba como resultado una inducción típica de segundo mensajero dependiente de GPCR, v.g. nucleósidos cíclicos (cAMP, cGMP), inositol-trifosfato (IP3) o calcio. (Kinnamon y Cummings, 1992; Kinnamon y Margolskee, 1996; Lindemann, 1966a). La participación de GCPRs en la percepción del sabor se vio respaldada ulteriormente por el descubrimiento de la proteína g gustducina expresada específicamente en las células del gusto de los vertebrados. (McLaughlin et al., 1992; Wong et al., 1996). Por otra parte, era conocido por estudios genéticos en ratones que la capacidad para sentir el sabor dulce de, v.g., la sacarina estaba ligada al denominado locus sac en el cromosoma 4 del ratón. (Bachmanov et al., 2001; Lush, 1989; Lush et al., 1995). Basándose en estos datos, era obvio investigar marcadores de secuencia GPCR en bibliotecas de cDNA sustraídas derivadas de células del gusto o por realización de escaneos de secuencia genómica para estrechar ulteriormente el locus sac del ratón con vistas a la identificación de análogos de GPCR como receptores supuestos del gusto. Estos dos enfoques condujeron a las secuencias de DNA de receptores de rata, ratón y humanos para los GPCRs del gusto T1R1 y T1R2 (Hoon et al., 1999; Hoon y Ryba, 1997) Así como T1R3. (Kitagawa et al., 2001; Li et al., 2001; Max et al., 2001; Montmayeur et al., 2001; Sainz et al., 2001). Las alineaciones de homología revelaron que estos receptores del gusto como el receptor de glutamato metabotrófico homodímero (mGluR), el receptor de ácido ?-aminobutírico heterodímero tipo B (GABA_BR) y los receptores homodímeros de calcio extracelular son miembros de la pequeña familia de GPCRs de clase C. Como característica común, la mayoría de los receptores de la clase C exhiben un gran dominio aminoterminal extracelular compuesto de un denominado módulo atrapamoscas de Venus (VFTM) y un dominio rico en cisteína (CRD) que conecta el VFTM al dominio heptahelicoidal. (Pin et al., 2003). Además de ello, se describió homo- y hetero-oligomerización para varios de estos receptores de clase C. (Bai et al., 1998; Kaupmann et al., 1998; Kunishima et al., 2000; White et al., 1998). Consiguientemente, el rasgo característico de la oligomerización GPCR de los receptores de clase C fue testado para los receptores supuestos del sabor dulce T1R1, T1R2 y T1R3.

Por expresión heteróloga recombinante en sistemas de células eucariotas, se demostró una expresión funcional y activación específica de saborizantes de una cascada de señalización dependiente de proteína G enlazada artificialmente, por obtención de imágenes de calcio. Los receptores T1R se ensamblan para construir receptores de sabor funcionales. Como resultado de varias investigaciones se demostró que el T1R1/T1R3 heterodímero funciona como un receptor de glutamato (umami) y de L-aminoácidos, mientras que el heterodímero T1R2/T1R3 funciona como un receptor de alta afinidad de azúcar y edulcorantes artificiales. Particularmente, la co-expresión heterodímera de T1R1 y T1R3 da como resultado receptores del sabor que responden a los estímulos del sabor de umami y de glutamato monosódico, en tanto que la co-expresión heterodímera de T1R2 y T1R3 da como resultado receptores de sabor que responden a estímulos dulces tales como diversos azúcares (v.g. glucosa y sacarosa), edulcorante artificial (v.g. acesulfamo K, ciclamato, sacarina) y proteínas dulces como monelina, taumatina, brazzeína (Li et al., 2002; Nelson et al., 2002; Nelson et al., 2001; Zhao et al., 2002). Podría generarse una crónica similar para la identificación de GPCRs para la percepción del sabor amargo con la excepción de que, hasta ahora, no se ha informado de homo- u oligomerización alguna para estos denominados T2R-GPCRs. (Meyerhof et al., 2005).

La identificación arriba expuesta de genes codificantes de receptores responsables v.g. de la percepción del sabor, junto con la clonación de dichos genes en vectores apropiados para la expresión de dichas proteínas en células eucariotas y la transformación de dichas células con dichos vectores generó la expectativa de que sistemas de cribado y/o métodos de cribado para modulares GPCR, es decir agonistas y antagonistas de los receptores detallados anteriormente, podría ser fácil de desarrollar en un tiempo razonable.

Esto se refleja por un número enorme y todavía creciente de publicaciones y solicitudes de patente en este campo.

Loison et al. (2002) describen el uso de un vector bicistrónico para la expresión de un GPCR.

La clonación de T1R1 se describe en diferentes solicitudes de patente, v.g. en WO 03/025137; en WO 00/06952 (en donde aquél se designa GPCR-B3), US020040191862A1 y WO 2005/033125.

La clonación de T1R2 se describe en las solicitudes de patente WO 03/025137, US020040191862A1 y US020030040045A1.

La clonación de T1R3 se describe en las solicitudes de patente WO 03/025137, WO 03/025137 (sic), US020040191862A1 y US020030040045A1.

Un sistema para la expresión de dichas proteínas en células eucariotas se describe en las solicitudes de patente WO 03/025137, WO 00/06952, US20040191862A1, W02004069191 y US20030040045A1.

Un...

1. Un método para la identificación de moduladores de GPCRs, que comprende los pasos de:

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula hospedadora se selecciona del grupo constituido por: HEK293 (riñón de embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humano negroide), HT29 (adenocarcinoma de colon humano caucasiano grado II), A431 (carcinoma escamoso humano), IMR32 (neuroblastoma humano caucasiano), K562 (leucemia mielógena humana caucasina crónica), U937 (linfoma histiocítico humano caucasiano), MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama humano caucasiano), SK-N-BE(2) (neuroblastoma humano caucasiano), SH-SY5Y (neuroblastoma humano), HL60 (leucemia humana promielocítica) o líneas de células eucariotas no humanas como CHO-K1 (ovario de hámster chino), COS-7 (riñón de mono verde africano, transformadas con SV40), S49 (linfoma de ratón), Ltk (tejido conectivo de ratón C34/An), NG108-15 (híbrido Neuroblastoma de ratón x Glioma de rata), B50 (tejido nervioso neuronal de rata, ECACC), C6 (tumor glial de rata), Jurkat (linfoblastos de células T de la leucemia humana), BHK (riñón de hámster sirio), Neuro-2a (neuroblastoma de ratón albino), NIH/3T3 (fibroblastos de embrión de ratón), preferiblemente HEK (riñón de embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humano negroide), CHO-K1 (ovario de hámster chino) o Neuro 2a (neuroblastoma de ratón albino).

3. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el uno o más GPCR(s) es un GPCR de tipo T1R, especialmente T1R1, T1R2 y/o T1R3.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dos o más GPCRs se expresan en una co-expresión heteróloga de al menos dos GPCRs diferentes de tipo T1R, preferiblemente T1R1/T1R3, y más preferiblemente T1R2/T1R3.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la transformación se realiza con un vector de clonación tricistrónico o tetracistrónico.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el promotor es un promotor fuerte adecuado para uso en la célula hospedadora seleccionada, que se selecciona preferiblemente del grupo constituido por el promotor de citomegalovirus (P-CMV), el promotor del factor de elongación humana 1-alfa (P-E1a), el promotor ubiquitina humano (P-ubi), el promotor del virus de los simios (P-SV40), el promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (P-RSV-LTR),

en donde el GPCR1 y el GPCR2, independientemente uno de otro, se seleccionan del grupo constituido por receptores de sabor T1R y T2R, preferiblemente del grupo de receptores T1R, más preferiblemente una combinación de T1R/T1R3 o T1R2/T1R3,

en donde el marcador de selección se selecciona del grupo constituido por higromicina, zeocina^r, neomicina^r, blasticidina^r o puromicina^r;

en donde ambos GPCR₁ y GPCR₂, así como el marcador de selección están conectados funcionalmente por IRES interpuestos seleccionados del grupo constituido por IRES_EMCV, derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_EMCV); IRES_GTX, derivado del mRNA del homeodominio GTX; IRES_Rbm3, derivado de Rbm3 inducible por frío; IRES_PV, derivado de origen polioviral, IRES_RV, derivado de rinovirus, IRES_FMDV, derivado del virus de la fiebre aftosa; IRES_HV, derivado del virus de la hepatitis C, IRES_CSFV, derivado del virus de la fiebre porcina clásica, IRES_BVDV, derivado del virus de la diarrea viral de los bovinos; IRES_FMLV, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Friend; IRES_MMLV, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Moloney; IRES_HIV, derivado del mRNA env del virus de la inmunodeficiencia humana; IRES_PSIV, derivado del virus intestinal de Plautia stali; IRES_RPV, derivado del virus de Rhopalosiphum padi; IRES_KSH, derivado del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, preferiblemente el IRES_EMCV derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_EMCV),

y en donde la unidad de expresión multicistrónica está terminada por una señal de poliadenilación.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el vector de clonación multicistrónico comprende además un cistrón que codifica una proteína G, preferiblemente G-alfa15, estando localizada preferiblemente la proteína g entre el último GPCR y el marcador de selección, y estando conectada funcionalmente a ambos por un IRES como se define en la reivindicación 5.

8. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el modulador se selecciona del grupo constituido por pequeñas moléculas y/o péptidos.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la respuesta celular se determina por medición del cambio de los niveles de calcio intracelulares con relación a los niveles de calcio intracelulares sin poner en contacto la célula con el modulador.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el cambio es un aumento.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el cambio es una disminución con relación a los niveles de calcio intracelulares cuando la célula está en contacto con un compuesto dulce en lugar del modulador, seleccionándose preferiblemente el compuesto dulce del grupo constituido por glucosa, fructosa, sacarosa, acesulfamo K, sacarina, ciclamato, aspartamo, xilitol, esteviósido, sucralosa, taumatina, monelina, brazzeína, perillartina, glicirricina, ácido sucrónico, P-4000, SC45647, NC174, neohesperidina y aminoácidos de sabor dulce.

12. Molécula de ácido nucleico que codifica un T1R1, T1R2 o T1R3 representado en una de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

13. Vector de expresión multicistrónico que comprende aguas abajo de un promotor para la expresión en una célula eucariota y enlazados funcionalmente al mismo los cistrones siguientes:

en donde el promotor es preferiblemente un promotor fuerte adecuado para uso en la célula hospedadora seleccionada, seleccionándose más preferiblemente del grupo constituido por: el promotor de citomegalovirus (P-CMV), el promotor del factor de elongación humano 1-alfa (P-E1a), el promotor ubiquitina humano (P-ubi), el promotor del virus de los simios (P-SV40), el promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (P-RSV-LTR),

en donde el GPCR₁ y el GPCR₂ se seleccionan, independientemente uno de otro, del grupo constituido por los receptores de sabor T1R o T2R, preferiblemente del grupo de receptores T1R, más preferiblemente una combinación de T1R1-T1R3 o T1R2-T1R3,

en donde el marcador de selección se selecciona del grupo constituido por higromicina^r, zeocina^r, neomicina^r, blasticidina^r o puromicina^r,

en donde tanto el GPCR1 como el GPCR2, así como el marcador de selección están conectados funcionalmente por IRES interpuestos seleccionados del grupo constituido por IRES_EMCV, derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_EMCV); IRES_GTX, derivado del mRNA del homeodominio GTX; IRES_Rbm3, derivado de Rbm3 inducido por frío; IRES_pv, derivado de origen polio-viral, IRES_RV, derivado de rinovirus, IRES FMDV, derivado del virus de la fiebre aftosa; IRE_HV, derivado del virus de la hepatitis C, IRES_CSFV, derivado del virus de la fiebre porcina clásica, IRES_BVDV, derivado del virus de la diarrea viral de los bovinos; IRES_FMLV, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Friend; IRES_MMLV, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Moloney; IRES_HIV, derivado del mRNA env del virus de la inmunodeficiencia humana; IRES_PSIV, derivado del virus intestinal de Plautia stali; IRES_RPV, derivado del virus de Rhopalosiphum padi; IRES_KSH, derivado del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, preferiblemente el IRES_EMCV, derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_EMCV) y

en donde la unidad de expresión multicistrónica está terminada por una señal de poliadenilación.

14. Un vector de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el vector de clonación multicistrónico comprende adicionalmente un cistrón que codifica una proteína g o un equivalente de la misma, preferiblemente G-alfa 15 o un equivalente de la misma, la proteína g o un equivalente de la misma, estando preferiblemente la proteína g fusionada en marco al GPCR₁ y/o GPCR₂ anteriores.

15. Líneas de células transfectadas de manera estable con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, preferiblemente un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14.