METODO Y SONDAS PARA EL DIAGNOSTICO GENETICO DE LA HEMOCROMATOSIS.

Sonda para el diagnóstico de la hemocromatosis, caracterizada porque la sonda es capaz de hibridarse con los ácidos nucleicos de una muestra biológica en una región que corresponde a una región de la secuencia de cADN del gen HFE que contiene el nucleótido 502 para determinar si existe una mutación G- T en la posición 502 de la secuencia de cADN del gen HFE

Método y sondas para el diagnóstico genético de la hemocromatosis.

La invención se refiere a un método para el diagnóstico genético de la hemocromatosis, así como a sondas para el diagnóstico genético de la hemocromatosis.

La Hemocromatosis Hereditaria (HH) /11/ es una enfermedad autosomal recesiva común que se caracteriza por un trastorno del metabolismo del hierro en el cuerpo humano que conduce a una sobrecarga progresiva de hierro. El hierro en exceso se deposita en diversos órganos, principalmente el hígado, el corazón y el páncreas, causando daños irreversibles y enfermedades tales como cirrosis hepática, diabetes, artritis, cardiomiopatías y muerte prematura. Con un diagnóstico temprano y un tratamiento por flebotomía terapéutica se puede prevenir completamente el daño a los órganos y la esperanza de vida de los pacientes es la normal. Debido a que, a menudo, los síntomas clínicos de la hemocromatosis no aparecen antes de los 40, 50 o más años de edad, cuando pueden existir ya daños irreversibles en los órganos, es preferible un diagnóstico presintomático.

Se ha identificado un número de mutaciones puntuales en un nuevo gen de tipo MHC clase I denominado HFE (locus 6p) y que están relacionadas con HH /1,7,9/. Este gen codifica una proteína que interactúa con el receptor de la transferrina (TFRC) y que afecta negativamente a la captación de hierro celular de la transferrina /36/. En 1996 se identificó el gen HFE y se han descrito originalmente dos mutaciones, C282Y y H63D /1/. Estas dos mutaciones se utilizan actualmente para el diagnóstico genético de la hemocromatosis.

La H63D es una mutación C rightarrow G en el codón 63, que transforma el aminoácido 63 de histidina en ácido aspártico. Debido a su alta frecuencia en la población general, su papel en el diagnóstico de la enfermedad sigue siendo dudoso.

Un criterio mucho mejor para el diagnóstico de la hemocromatosis es la mutación de C282Y, encontrada en el 65% hasta el 95% de los pacientes en cuestión. C282Y es una mutación G rightarrow A en el nucleótido 845 de la secuencia de cADN de HFE que convierte el aminoácido 282 de cisteína a tirosina. Por tanto, la mayoría de los pacientes con HH son homocigóticos para la C282Y /1,13,14,15/. Entre las probandas de HH, los heterocigotos compuestos para C282Y/H63D dan cuenta de aproximadamente un 5-7% /1,16/, los homocigotos para H63D son muy raros y, en general, ambos tienen una forma suave de hemocromatosis /17/. Una minoría de casos que se presentan con un fenotipo HH son heterocigotos para C282Y o H63D o ni C282Y ni H63D. Parece que esto es más común en el sur de Europa que en el norte de Europa /18/19/. Esto significa que el porcentaje de pacientes con hemocromatosis que no presentan una mutación de C282Y varía, siendo, por ejemplo, más alta en Italia que en los países del norte de Europa. En un estudio de colaboración que incluía 188 pacientes italianos con el fenotipo tipo HH, se caracterizó incompletamente un 28% con al menos un cromosoma sin una mutación asignada /19/. En algunos de estos pacientes se ha sugerido la presencia de otras mutaciones de HFE u otros determinantes genéticos unidos en 6p o la existencia de otra forma de sobrecarga genética de hierro no ligada al cromosoma 6 /19,20,21/. Se han descubierto recientemente tres nuevas mutaciones de HFE en el estado heterocigoto en asociación con C282Y en casos únicos con HH clásica: una mutación del sitio de empalme (IVS3 + 1G rightarrow T) causando un salto obligado del exón 3 /22/ y dos mutaciones de sentido erróneo (1105T y G93R) localizadas en el dominio a1 que pueden afectar a la unión de la proteína del HFE al receptor de transferrina /23/. Además, se descubrió que la mutación de sentido erróneo S65C estaba enriquecida notablemente en cromosomas de HH que no eran C282Y ni H63D, lo que sugiere que S65C podría ser otra variante que contribuye a una forma suave de HH en asociación con C282Y o H63D /9/. Se han descrito recientemente otras mutaciones de sentido erróneo, pero su papel en la patogénesis de HH sigue siendo poco claro /7/.

Aunque se observa una homocigocidad para C282Y en la mayoría de los pacientes caucasianos con HH y es bien reconocida como la causa de la enfermedad, el valor de diagnóstico de otras mutaciones de HFE sigue investigándose. Sería particularmente interesante definir las mutaciones causantes de la enfermedad en aquellos pacientes con HH que no son homocigotos para C282Y.

Por tanto, es importante encontrar -además de las mutaciones conocidas- otras causas genéticas en el gen HFE u otros genes que pueden conducir al exceso de hierro en un paciente.

Por esta razón, el problema de la presente invención consiste en encontrar otras posibilidades para diagnosticar las causas genéticas de la hemocromatosis.

El problema se resuelve mediante el examen de una muestra biológica en busca de la presencia de una mutación G rightarrow T en el nucleótido 502 de la secuencia de cADN de HFE. Esta mutación se descubrió durante el reconocimiento de cinco pacientes italianos no relacionados heterocigotos para C282Y con el fenotipo clásico de hemocromatosis. La mutación (nt 502 G rightarrow T o E168X) se identificó en el exón 3 del cromosoma negativo C282Y. La mutación G rightarrow T en el nucleótido 502 provoca la conversión del aminoácido 168 correspondiente de ácido glutámico a un codón de parada (E168X).

La presente descripción se refiere también al examen de una muestra biológica en busca de la presencia de una mutación G rightarrow C en el nucleótido 502 de la secuencia de cADN de HFE. Esta mutación en el exón 3 (nt 502 G rightarrow C o E168Q) se identificó en una mujer caucásica sudafricana de 79 años de edad. Era también heterocigota para la mutación de H63D y su ferritina en suero era moderadamente elevada en el momento de la prueba (242 ng/ml; valores de referencia: 12-119 ng/ml). Se presentó sin síntomas clínicos notables, pero tenía un historial familiar tanto de enfermedad cardíaca como de distintos tipos de cáncer. Se identificó inicialmente una mutación de E168Q mediante un análisis del polimorfismo de conformación de una sola hebra /7/ (SSCP) y se confirmó posteriormente por secuenciación del ADN. La mutación G rightarrow C en el nucleótido 502 causa la conversión del aminoácido 168 correspondiente de ácido glutámico a glutamina (E168Q).

Preferentemente, la muestra biológica se examina adicionalmente en busca de la presencia de una mutación G rightarrow A en el nucleótido 845 y/o una mutación C rightarrow G en el nucleótido 187 de la secuencia de cADN de HFE, de modo tal que pueda tener lugar un diagnóstico de hemocromatosis aunque se encuentre sólo una de estas mutaciones conocidas.

El problema se resuelve además mediante el examen de una muestra biológica en busca de la presencia de ácidos nucleicos que codifican para los productos de HFE con una sustitución de ácido glutámico por glutamina o un codón de parada en el aminoácido 168 (E168Q, E168X) o el examen de una muestra biológica en busca de la presencia de un producto genético de HFE con una sustitución de ácido glutámico por glutamina o un codón de parada en el aminoácido 168 (E168Q, E168X).

Las mutaciones puntuales conocidas en el estado de la técnica o de acuerdo con la presente invención y descritas anteriormente provocan ciertas sustituciones de aminoácidos y se han encontrado en pacientes afectados de hemocromatosis. Sin embargo, las sustituciones de aminoácidos descritas anteriormente también ser resultado de mutaciones distintas a dichas mutaciones conocidas o mutaciones de acuerdo con la presente invención y conducirán por ello a una afección o una situación portadora. Por tanto, el examen de una muestra biológica en busca de la presencia de una o más de las sustituciones de aminoácidos anteriores proporcionará información sobre si el paciente del que procede la muestra biológica está afectado por o es portador de hemocromatosis.

Como muestra biológica se puede utilizar sangre, tejido biópsico, frotis de la cavidad oral, fluido amniótico o similar y la muestra biológica se somete a un pretratamiento conocido de acuerdo con el procedimiento conocido seleccionado de reconocimiento.

Cuando se examina también la muestra biológica en busca de la presencia de ácidos nucleicos que no muestran las mutaciones mencionadas o las sustituciones de aminoácidos en su gen HFE o productos genéticos respectivos, se puede demostrar si las mutaciones son heterocigotas u homocigotas.

 

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Reivindicaciones:

1. Sonda para el diagnóstico de la hemocromatosis, caracterizada porque la sonda es capaz de hibridarse con los ácidos nucleicos de una muestra biológica en una región que corresponde a una región de la secuencia de cADN del gen HFE que contiene el nucleótido 502 para determinar si existe una mutación G rightarrow T en la posición 502 de la secuencia de cADN del gen HFE.

 

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