METODO PARA LA PRODUCCION DE ACIDOS GRASOS POLIINSATURADOS, NUEVOS GENES DE BIOSINTESIS Y NUEVOS CONSTRUCTOS VEGETALES DE EXPRESION.

Método para producir ésteres de ácido graso con un contenido elevado de ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles caracterizado porque se introduce a un organismo no humano,

productor de ésteres de ácido graso, al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo de

a) Un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11,

b) Ácidos nucleicos que se obtienen debido al código degenerado mediante retraducción de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12,

c) Derivados de los ácidos nucleicos representados en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 que codifican para partes biológicamente activas de una desaturasa y presentan al menos 50% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12,

se hace crecer el organismo y se aíslan los ésteres de ácido graso obtenidos del organismo

Método para la producción de ácidos grasos poliinsaturados, nuevos genes de biosíntesis y nuevos constructos vegetales de expresión.

La presente invención se refiere a un método para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles y/o un método para la preparación de triglicéridos con contenido elevado de ácidos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles. La invención también se refiere al uso ventajoso de las secuencias de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ó 11 en el método y para la preparación de un organismo transgénico, preferible de un vegetal transgénico o de un microorganismo transgénico con contenido elevado de ácidos grados, aceites o lípidos con ácidos grasos insaturados de C₁₈, C₂₀, o C₂₂.

La invención también se refiere a desaturasas novedosas con [falta] que en las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 11 o sus homólogos, derivados o análogos y constructos génicos que comprenden estos genes o sus homólogos, derivados o análogos, así como a su uso solos o en combinación con genes de biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados, tal como se representa ventajosamente en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9.

Adicionalmente, la invención se refiere a secuencias aisladas de ácidos nucleicos; a casetes de expresión que contienen las secuencias de ácidos nucleicos, vectores y organismos transgénicos que contienen al menos una secuencia de ácidos nucleicos o un casete de expresión. Además, la invención se refiere a ácidos grasos insaturados con al menos dos enlaces dobles y a triglicéridos con un contenido elevado de ácidos grasos insaturados con al menos dos enlaces dobles y a su uso.

Además, la invención se refiere a casetes de multiexpresión para la expresión específica de semillas y a vectores y a organismos que comprenden un gen de desaturasa solo o en combinación con otras desaturasas con la secuencia SEQ ID NO: 7 y/o genes de elongasa con la secuencia ID NO: 9 o sus homólogos, derivados o análogos usando dichos casetes de expresión.

Una serie de productos y productos secundarios de procesos metabólicos de procedencia natural en microorganismos, células animales y vegetales son aprovechables para muchas ramas de la industria, incluyendo la industria de forrajes y alimentos para animales, industria de alimentos, cosméticos y farmacéuticos. Estas moléculas, denominadas de manera general como "productos químicos finos" incluyen, por ejemplo, lípidos y ácidos grasos, entre los cuales los ácidos grasos poliinsaturados son una clase ejemplar. Los ácidos grasos y triglicéridos tienen una gran cantidad de aplicaciones en la industria de productos alimenticios, de la alimentación para animales, de la cosmética y en el campo de la farmacia. Según si se trata de ácidos grasos saturados o insaturados o si se trata de triglicéridos con un contenido elevado de ácidos grasos saturados o insaturados, éstos son adecuados para las más diversas aplicaciones; así, por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) se adicionan a la alimentación para bebés para elevar el valor nutritivo. Los PUFAs tienen además una influencia positiva en el nivel de colesterol en la sangre de las personas y, por lo tanto, son adecuados para la protección frente a enfermedades coronarias. De esta manera encuentran aplicación en diversos productos alimenticios dietéticos o en medicamentos.

Microorganismos particularmente adecuados para la producción de PUFAs son microorganismos tales como cepas de thraustochytridos o schizochytridos, algas como del tipo Phaeodactylum tricornutum o Crypthecodinium, ciliados como Stylonychia o Colpidium, hongos como Mortierella, Entomophthora o Mucor. Mediante selección de cepas se ha desarrollado una cantidad de cepas mutantes de los microorganismos correspondientes que producen una serie de compuestos deseables, incluyendo PUFAs. La selección de cepas con producción mejorada de una molécula determinada es, no obstante, un proceso difícil que quita tiempo.

De manera alterna, la producción de productos químicos finos puede llevarse a cabo a gran escala de una manera adecuada mediante la producción de vegetales que se hayan desarrollado de tal modo que produzcan los PUFAs previamente mencionados. Vegetales adecuados, particularmente buenos para este propósito, son plantas oleaginosas que contienen grandes cantidades de compuestos lípidos, tales como colza, canola, linaza, soya, girasol, borraja y onagra. Pero también son bien adecuadas otras plantas útiles que contienen aceites o lípidos y ácidos grasos, tal como se menciona en la presente descripción de esta invención. Por medio de cultivo convencional se ha desarrollado una serie de plantas mutantes que producen un espectro de lípidos y ácidos grasos deseables, co-factores y enzimas. Sin embargo, la selección de nuevas variedades vegetales con producción mejorada de una molécula determinada es un proceso dispendioso y difícil o incluso imposible si el compuesto no tiene lugar de manera natural en la planta correspondiente, como en el caso de ácidos grasos poliinsaturados de C₁₈, C₂₀ y C₂₂ y aquellos con cadenas de carbono más largas.

Debido a las propiedades positivas de los ácidos insaturados no han faltado intentos en el pasado de poner a disposición genes que participen en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para la producción de aceites en diversos organismos con contenido modificado de ácidos insaturados. Así, en WO 91/13972 y su equivalente estadounidense se describe una ?-9-desaturasa. En WO93/11245 se reivindica una ?-15-desaturasa, en WO 94/11516 se reivindica una ?-12-desaturasa. Se describen ?-6-desaturasas en WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022 y WO 99/27111. Otras desaturasas se describen, por ejemplo, en EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey y colaboradores, J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada y colaboradores, Nature 347, 1990: 200-203 o Huang y colaboradores, Lipids 34, 1999: 649-659. En WO 96/13591 se describe y se reivindica una ?-6-Palmitoil-ACP-desaturasa. No obstante, la caracterización bioquímica de las diferentes desaturasas se ha efectuado hasta ahora de manera insuficiente solo porque las enzimas son muy difíciles de aislar y de caracterizar (McKeon y colaboradores, Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang y colaboradores, Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792).

En levaduras pudo detectarse tanto un desplazamiento del espectro de ácido graso hacia ácidos grasos insaturados como también un incremento de la productividad (véase Huang y colaboradores, Lipids 34, 1999: 649-659, Napier y colaboradores, Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614). Sin embargo, la expresión de las diversas desaturasas en vegetales transgénicos no mostró el éxito deseado. Pudo mostrarse un desplazamiento del espectro de ácido graso hacia ácidos grasos insaturados, pero simultáneamente se mostró que el desempeño de síntesis de las plantas transgénicas decae fuertemente, lo que significa que frente a las plantas de partida pudieron aislarse solo cantidades bajas de aceites.

Ni en levaduras ni en plantas se producen de manera natural ácidos grasos poliinsaturados de C₂₀ y/o C₂₂ con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, como ácido araquidónico (ARA) y/o ácido eicosapentaenoico (EPA) y/o ácido docosahexaenoico (DHA).

Por lo tanto aún existe una gran demanda de genes novedosos, que codifiquen para enzimas, que participen en la biosíntesis de ácidos grasos insaturados y que hagan posible producirlos a una escala industrial. Ninguna de los procesos biotecnológicos conocidos hasta ahora para la producción de ácidos grasos poliinsaturados proporciona los ácidos grasos ya mencionados en cantidades utilizables económicamente.

Por lo tanto, existía el problema de suministrar otras enzimas adicionales para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados. Y usar opcionalmente estas enzimas con otras enzimas para producir ácidos grasos poliinsaturados. Este problema fue resuelto mediante el proceso según la invención para la producción de ésteres de ácidos grasos con un contenido elevado de ácidos grasos poliinsaturados que tienen al menos dos enlaces dobles, el cual se caracteriza porque al menos una secuencia de ácidos nucleicos seleccionados del grupo de

a) un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11,

b) ácidos nucleicos...

1. Método para producir ésteres de ácido graso con un contenido elevado de ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles caracterizado porque se introduce a un organismo no humano, productor de ésteres de ácido graso, al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo de

a) Un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11,

b) Ácidos nucleicos que se obtienen debido al código degenerado mediante retraducción de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12,

c) Derivados de los ácidos nucleicos representados en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11 que codifican para partes biológicamente activas de una desaturasa y presentan al menos 50% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 ó 12,

se hace crecer el organismo y se aíslan los ésteres de ácido graso obtenidos del organismo.

2. Método según la reivindicación 1, en el cual los ésteres de ácidos grasos producidos mediante el método contienen moléculas de de ácido graso poliinsaturadas de C₁₉, C₂₀ o C₂₂ con al menos dos enlaces dobles en el éster de ácido graso.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que las moléculas de ácido graso de C₁₈, C₂₀ o C₂₂ se aíslan del organismo en forma de un aceite o lípido.

4. Método según las reivindicaciones 1 hasta 3, en el que el organismo es un microorganismo, un animal no humano o un vegetal.

5. Método según las reivindicaciones 1 hasta 4, en el que el organismo es una planta transgénica.

6. Método según las reivindicaciones 1 hasta 5, en el que los ésteres de ácido graso contienen ácidos grasos de C₁₈, C₂₀ o C₂₂ con tres, cuatro o cinco enlaces dobles en el éster de ácido graso.

7. Método según las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado porque se liberan los ácidos grasos poliinsaturados contenidos en los ésteres de ácido graso.

8. Ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido con actividad de desaturasa y que se selecciona del grupo de:

a) Un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11,

b) Ácidos nucleicos que se obtienen debido al código genético degenerado mediante retraducción de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12,

c) Derivados de los ácidos nucleicos representados en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11,

que codifican para partes biológicamente activas de una desaturasa y al menos 50% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 o 12.

9. Polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 8.

10. Polipéptido según la reivindicación 9 codificado por la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11.

11. Constructo de ácido nucleico que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 8, y el ácido nucleico está conectado con una o varias señales de regulación.

12. Constructo de ácido nucleico según la reivindicación 11, y en el constructo de ácido nucleico se encuentran contenidos genes adicionales de biosíntesis del metabolismo de ácido graso o lípido.

13. Constructo de ácido nucleico según la reivindicación 11 ó 12, y como gen de biosíntesis del metabolismo de ácido graso o lípido que está contenido en el constructo de ácido nucleico se selecciona un gen del grupo acil-CoA-dehidrogenasa(s), acil-ACP[= acil carrier protein]-desaturasa(s), acil-ACP-tioesterasa(s), ácido graso-acil-transferasa(s), ácido graso-suntasa(s), ácido graso-hidroxilasa(s), acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acil-coenzima A-oxidasa(s), ácido graso-desaturasa(s), ácido graso-acetilenasas, lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasas, alenoxid-sintasas, hidroperóxido-liasas o ácido graso-elongasa(s).

14. Vector que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 8 o un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 11.

15. Planta transgénica que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 8, un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 11 o un vector según la reivindicación 14.

16. Uso de un ácido nucleico según la reivindicación 8 o de un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 11 para la producción de plantas transgénicas.

17. Anticuerpo que enlaza específicamente un polipéptido que se codifica por uno de los ácidos nucleicos según la reivindicación 8 a) o b).

18. Molécula de ácido nucleico antisense que comprende la secuencia complementario del ácido nucleico según la reivindicación 8.

19. Kit que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 8, el constructo de ácido nucleico según las reivindicaciones 11 hasta 13, el anticuerpo según la reivindicación 17, o la molécula de ácido nucleico antisense según la reivindicación 18.

20. Composición que contiene el anticuerpo según la reivindicación 17 o constructo de ácido nucleico antisense según la reivindicación 18.