METODO PARA ELABORAR ACIDOS GRASOS POLIINSATURADOS MEDIANTE UN NUEVO GEN DE ELONGASA.

Método para la preparación de moléculas de ácidos grasos de C20 o C22 con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso;

el método comprende el cultivo de un microorganismo o de una planta, el/la cual comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que alarga ácidos grasos de C16 o C18 que tienen al menos dos enlaces dobles en el ácido graso en al menos dos átomos de carbono; se prefieren los ácidos grasos C18:3? 6,9,12, C18:4? 6,9,12,15 y C16;3? 7,10,13 al menos en el factor 1,5 frente a los ácidos insaturados C18:2? 9,12, C18:3? 4,7,10, C18:3? 5,8,11, C18:3? 7,10,13, C18:3? 8,11,14, C18:3? 9,12,15 o C18:3? 5,c9,12; los ácidos grasos C18:3? 5t,9,12, C20:3? 8,11,14, C20:4? 5,8,11,14 y C20:5? 5,8,11,14,17 no se alargan y el ácido nucleico se selecciona del grupo compuesto de

a) una secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO:1,

b) una secuencia de ácido nucleico que se deriva según el código genético degenerado de la secuencia representada en SEQ ID NO: 2,

c) Derivados de la secuencia representada en SEQ ID NO:1 que codifican polipéptidos que son idénticos al menos en 50% a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:

Método para elaborar ácidos grasos poliinsaturados mediante un nuevo gen de elongasa.

Esta invención se refiere a métodos para la producción de moléculas de ácido graso de C₂₀ o C₂₂ con al menos dos enlaces dobles donde se emplea un gen de elongasa con la secuencia SEQ ID NO:1 o sus homólogos, derivados o análogos, una construcción genética que comprende este gen o sus homólogos, derivados o análogos.

Determinados productos y productos secundarios que proceden naturalmente de procesos metabólicos en células microbianas o en las células de animales y ventajosamente de plantas son útiles para un amplio espectro de industrias, incluyendo la industria de alimentos para animales, productos alimenticios para humanos, cosméticos y fármacos. Estas moléculas que en conjunto se denominan "sustancias químicas finas", también incluyen lípidos y ácidos grasos, entre los cuales los ácidos grasos poliinsaturados constituyen un ejemplo de una clase. Se agregan ácidos grasos poliinsaturados (polyunsaturated fatty acids, PUFAs), por ejemplo, al alimento para niños para incrementar el valor nutricional de estos alimentos. Por ejemplo, los PUFAs tienen un efecto positivo en el nivel de colesterol en la sangre de los humanos y por lo tanto son adecuados para la protección contra padecimientos cardiacos. Las sustancias químicas finas tales como ácidos grasos poliinsaturados (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) pueden aislarse de fuentes animales, por ejemplo de pescado, o producirse a gran escala utilizando microorganismos por medio del cultivo de microorganismos los cuales se han desarrollado de tal manera que los mismos produzcan y acumulen o secreten, grandes cantidades de una o más moléculas deseadas.

Los microorganismos que son especialmente adecuados para preparar PUFAs son microorganismos, tales como algas de la especie Phaeodactylum tricornutum o Crypthecodinium, Ciliatas como Stylonichia o Colpidium, hongos como Mortierella, Entomophthora, Mucor. Mediante la selección de cepas se ha desarrollado un número de cepas mutantes de los microorganismos correspondientes que producen una serie de compuestos deseables, incluyendo los PUFAs. La selección de cepas con producción mejorada de una molécula determinada de una molécula determinada es, no obstante, un método difícil y que consume tiempo.

Como una alternativa, las sustancias químicas finas pueden producir adecuadamente a gran escala por medio de la producción de plantas que se han desarrollado de tal manera que ellas producen los PUFAs antes mencionados. Plantas particularmente bien adecuadas para este propósito son plantas de frutos oleaginosos que contienen grandes cantidades de compuestos lípidos, tales como colza, canola, lino, soya, girasol, cardos, borraja y onagra. Sin embargo, otros cultivos que contienen aceites o lípidos y ácidos grasos son muy adecuados, como se mencionó en la descripción detallada de la presente invención. La reproducción de plantas convencionales por medio de la selección de plantas adecuadas, ha conducido a un desarrollo de una serie de plantas mutantes las cuales producen un espectro de lípidos y ácidos grasos, co-factores y enzimas deseables. Pero otras plantas útiles que contienen aceites o lípidos y ácidos grasos también son muy adecuadas, tal como se menciona en la descripción minuciosa de esta invención. Por medio del cultivo convencional, mediante la selección de plantas adecuadas, se ha desarrollado una serie de plantas mutantes que producen un espectro de lípidos y ácidos grasos, co-factores y enzimas deseables. La selección de nuevas variedades de plantas con producción mejorada de una molécula determinada es un procedimiento complicado que consume tiempo o que incluso es imposible si el compuesto no está presente de manera natural en la planta correspondiente, como en el caso de ácidos grasos de C₂₀ poliinsaturados y de aquellos con cadenas de carbono más largas.

Debido a las propiedades positivas de ácidos grasos insaturados no han faltado intentos en el pasado de poner a disposición genes que participan en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para producir aceites en diferentes organismos con contenido modificado de ácidos grasos insaturados. De esta manera, en WO 91/13972 y su equivalente estadounidense se describe una D-9-desaturasa. En WO 93/11245 se reivindica una D-15-desaturasa, en WO 94/11516 una D-12-desaturase. D-6-desaturasas se describen en WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022 y WO 99/27111. Otras desaturasas se describen en EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey y colaboradores, J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada y colaboradores, Nature 347, 1990: 200-203 o Huang y colaboradores, Lipids 34, 1999: 649-659. En WO 96/13591 se describe y se reivindica una D-6-palmitoil-ACP-desaturasa. La caracterización bioquímica de las diferentes desaturasas se ha efectuado hasta ahora solo de manera insuficiente ya que las enzimas como proteínas enlazantes de membrana solo pueden aislarse y caracterizarse con gran dificultad (McKeon y colaboradores, Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang y colaboradores, Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792).

En levaduras pudo detectarse tanto una desviación del espectro de ácidos grasos para producir ácidos grasos insaturados como también un incremento en la productividad (véase Huang y colaboradores, Lipids 34, 1999: 649-659, Napier y colaboradores, Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614). La expresión de las diferentes desaturasas en plantas transgénicas no mostró, sin embargo, el éxito deseado. Una desviación del espectro de ácido graso para producir ácidos grasos insaturados pudo mostrarse pero simultáneamente se mostró que el desempeño de síntesis de las plantas transgénicas decreció fuertemente, lo que significa que solo pequeñas cantidades de aceites pudieron aislarse en comparación con las plantas de partida.

La clonación y expresión de las elongasas que alongan los ácidos grasos insaturados como sustrato de la reacción enzimática en al menos dos átomos de C hasta ahora no se había descrito ni en levaduras ni en plantas.

Esto significa que ni las levaduras ni las plantas de cultivo producen de manera natural ácidos grasos poliinsaturados con C₂₀ y/o C₂₂ con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso como ácido araquidónico (ARA) y/o ácido eicosapentaenoico (EPA) y/o ácido docosahexaenoico (DHA).

Tanto ahora como antes existe aún una gran demanda de genes que codifican para enzimas que participan en la biosíntesis de ácidos grasos insaturados y hacen posible producirlos a escala industrial. Existe una demanda particularmente alta de elongasas que alongan los ácidos grasos insaturados en al menos dos átomos de C. Ninguno de los métodos biotecnológicos conocidos hasta ahora para la producción de ácidos grasos poliinsaturados proporciona los mencionados ácidos grasos en cantidades económicamente aprovechables.

En la expresión de genes siempre existen problemas, es decir que mediante la expresión no se llega al incremento esperado en la producción del producto valioso deseado.

Por esto, la tarea consistió en poner a disposición métodos para la síntesis de ácidos grasos insaturados tales como ácidos grasos poliinsaturados de C₂₀ y/o C₂₂ con al menos dos enlaces dobles en la molécula del ácido graso como el ácido araquidónico (ARA) y/o ácido eicosapentaenoico (EPA) y/o ácido docosahexaenoico (DHA).

Este problema se resolvió mediante el método según la reivindicación 1.

En este se usa un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, el cual alonga ácidos grasos de C₁₆ o C₁₈ con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, seleccionado del grupo que se compone de

a) una secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO:1,

b) una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la secuencia representada en SEQ ID NO:2 según el código genético degenerado,

c) derivados de la secuencia representada en SEQ ID NO:1 que codifica polipéptidos con al menos 50% de homología con la secuencia que codifica las secuencias de aminoácidos en SEQ ID NO:2; la secuencia actúa como elongasa de C₁₆ o C₁₈.

Ventajosamente, la secuencia de nucleótidos alonga ácidos grasos seleccionados del grupo previamente mencionado de C₁₆ o C₁₈ con al menos dos enlaces dobles en el ácido graso en al menos dos...

1. Método para la preparación de moléculas de ácidos grasos de C₂₀ o C₂₂ con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso; el método comprende el cultivo de un microorganismo o de una planta, el/la cual comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que alarga ácidos grasos de C₁₆ o C₁₈ que tienen al menos dos enlaces dobles en el ácido graso en al menos dos átomos de carbono; se prefieren los ácidos grasos C_18:3^{? 6,9,12}, C_18:4^{? 6,9,12,15} y C_16;3^{? 7,10,13} al menos en el factor 1,5 frente a los ácidos insaturados C_18:2^{? 9,12}, C_18:3^{? 4,7,10}, C_18:3^{? 5,8,11}, C_18:3^{? 7,10,13}, C_18:3^{? 8,11,14}, C_18:3^{? 9,12,15} o C_18:3^{? 5,c9,12}; los ácidos grasos C_18:3^{? 5t,9,12}, C_20:3^{? 8,11,14}, C_20:4^{? 5,8,11,14} y C_20:5^{? 5,8,11,14,17} no se alargan y el ácido nucleico se selecciona del grupo compuesto de

a) una secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO:1,

b) una secuencia de ácido nucleico que se deriva según el código genético degenerado de la secuencia representada en SEQ ID NO: 2,

c) Derivados de la secuencia representada en SEQ ID NO:1 que codifican polipéptidos que son idénticos al menos en 50% a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:2.

2. Método según la reivindicación 1, donde las moléculas de los ácidos grasos de C₂₀ o C₂₂ se aíslan del organismo en forma de un aceite, lípido o de un ácido graso libre.

3. Uso de un ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 1 para alargar ácidos grasos de C₁₆ o C₁₈ que tienen al menos dos enlaces dobles en el ácido graso en al menos dos átomos de carbono y se prefieren los ácidos grasos C_18:3^{? 6,9,12}, C_18:4^{? 6,9,12,15} y C_16:3^{? 7,10,13} al menos en el factor 1,5 frente a los ácidos grasos insaturados C_18:2^{? 9,12}, C_18:3^{? 4,7,10}, C_18:3^{? 5,8,11}, C_18:3^{? 7,10,13}, C_18:3^{? 8,11,14}, C_18:3^{? 9,12,15} o C_18:3^{? 5,c9,12} y no se alargan los ácidos grasos C_18:3^{? 5t,9,12}, C_20:3^{? 8,11,14}, C_20:4^{? 5,8,11,14} y C_20:5^{? 5,8,11,17}.