Un método para medir el contenido bacteriano de fluidos que comprende:

a. enlazar una cantidad efectiva de una glicoproteína con bacterias contenida en una muestra de fluido, dicha glicoproteína teniendo una funcionalidad enzimática generando una señal para indicar su presencia;

b. separar glicoproteína en exceso no enlazada de dicha muestra fluida después de reaccionar dicha glicoproteína con bacterias en dicha muestra en el paso (a);

c. medir la cantidad de dicho marcador que permanece después de separar dicha glicoproteína en exceso no enlazada de (b); y

d. determinar el contenido bacteriano de dicha muestra como relacionada a la cantidad de dicho marcador medido en el paso (c);

donde dicha glicoproteína es por lo menos un miembro del grupo que consiste de enzimas intracelulares y dichas enzimas inherentemente proveen una fracción de marcador que sirve como dicho marcador directamente enlazando dichas bacterias

Método de prueba bacteriana para enzimas glicadas intracelulares.

Antecedentes de la invención

Esta invención se relaciona en general con métodos para detectar bacterias en fluidos, particularmente en especímenes biológicos. Mas específicamente, la invención se relaciona con métodos rápidos para la detección de bacterias en orina y otros fluidos con mejorada precisión comparados con aquellos actualmente disponibles. Aunque el análisis de orina es de particular interés, otros fluidos, tales como sangre, suero, agua, y similares pueden ser analizados usando los métodos de la invención.

Es deseable una prueba rápida para bacterias, por ejemplo usando tiras de prueba secas del tipo ahora usado para diversos propósitos. En la actualidad, las tiras de prueba de orina son usadas para explorar muestras y descartar aquellas que no requieren evaluación de laboratorio. Sin embargo, las pruebas actuales, tales como medición de nitritos y leucocitos, no son capaces de proveer rápidamente resultados certeros. A menudo, se obtienen muchos resultados falsos, haciendo innecesarios análisis de seguimiento de laboratorio. Aproximadamente 50% de la carga de trabajo del laboratorio de un hospital involucra especímenes de orina y aproximadamente 90% de estos especímenes son cultivados y analizados para bacterias totales y gran negativas. Sin embargo, sólo aproximadamente 10% de las muestras de orina que son cultivadas para detección de bacterias tienen en efecto una prueba positiva. Claramente, una previa exploración correcta de la orina podría reducir grandemente el número de muestras enviadas al laboratorio para análisis.

La penetración de mercado de las tiras de prueba disponibles actualmente no es grande, en parte porque las pruebas producen resultados positivos falsos, tal como se determina después por análisis de seguimiento en el laboratorio. Por consiguiente, una tira de muestra que provee determinación rápida y certera de la presencia de bacterias reduciría costos y haría posible tratar bacterias en un paciente de inmediato, en lugar de esperar por resultados de laboratorio.

Los presentes inventores estaban investigando métodos por los cuales las bacterias pueden ser detectadas con exactitud. Un acercamiento potencial involucraba encontrar sustancias que podrían enlazarse a bacterias y después ser detectadas y medidas para que la cantidad de bacterias presente pudiera ser determinada. El problema puede ser planteado como sigue: Cómo se enlazan las sustancias a las bacterias y qué sustancias exhiben las propiedades necesarias para que se realicen medidas certeras? El enlace debería ser específico para bacterias. Enlaces no específicos pueden oscurecer los resultados ya que puede variar impredeciblemente y proveer resultados inexactos.

Los anticuerpos son reconocidos por tener la habilidad de unirse a las bacterias y se pensó que si la ALP (fosfatasa alcalina), que puede ser usada para detectar por desarrollo de color los materiales a los cuales se enlaza, podría ser unida a otra sustancia capaz de unirse por sí misma a las bacterias, sería posible medir la cantidad de bacterias presente. Al principio, los experimentos indicaban que la ALP estaba enlazada a bacterias de una forma no específica y por lo tanto se consideraba que presentaba un problema para el desarrollo de un método confiable para medir la cantidad de bacterias presente en una muestra. Posteriores investigaciones fueron dirigidas hacia la eliminación de enlaces no específicos de ALP para que sólo el ALP unido a las sustancias que puedan enlazarse a bacterias sea medidas. Sorprendentemente, se encontró que la creencia que la ALP se enlazaba no específicamente a las bacterias no era correcta y que de hecho, esta sí se enlazaba a bacterias, llevando a la presente invención. Como se verá más abajo, la ALP es una sustancia preferida para medir la cantidad de bacteria, pero pueden usarse otras sustancias, particularmente glicopéptidos y glicoproteínas.

Literatura relacionada y patentes

Se conocen métodos de pruebas rápidas para bacterias, pero difieren del método de la presente invención. En un método, un inmunoensayo para la detección de lipopolisacáridos de bacterias Gram negativas tal como E. coli, Clamidia o Salmonela usa una proteína de enlace lipopolisacárida o un anticuerpo que tiene afinidad de enlace específica al analito lipopolisacárido como un primero o segundo reactivo de enlace (véase WO 00/60354 y US 5,620,845). En US 5,866,344 se describen otros inmunoensayos para detectar polipéptidos de paredes celulares. Las proteínas pueden ser purificadas en un método usando polipéptidos de enlace polisacárido y sus conjugados (véase US 5,962,289; US 5,340,731; y US 5,928,917). En US 5,856,201 se revela la detección de proteínas usando proteínas de enlace polisacárido y sus conjugados. Los métodos descritos en lo anterior difieren de aquellos de la presente invención, como se verá en la discusión de la presente invención más abajo.

Los métodos que se basan en anticuerpos liposacáridos o proteínas de enlace no proveen una medida de las bacterias totales presentes. Estos tampoco usan un glicopéptido o glicoproteína para enlazarse a la célula bacteriana. Los métodos basados en polipéptidos requieren anticuerpos para enlazarse a la pared celular bacteriana en lugar de usar glicopéptidos o glicoproteínas. Los métodos basados en polipéptidos de enlace polisacárido requieren la fusión de secuencias cortas de polipéptidos en analitos de interés y usan polipéptidos no-glicados para enlazarse a un polisacárido.

Se ha demostrado que las glicoproteínas se enlazan a varias biomoléculas. Por ejemplo, se ha mostrado que las glicoproteínas en la superficie celular de hongos se enlazan a las proteínas del huésped. También, se ha demostrado que glicoproteínas excretadas de células epiteliales se enlazan a lípidos y el enlace de glicoproteínas a carbohidratos es bien conocido. Todas estas interacciones de glicoproteínas son dependientes de muchos factores, tales como fuerza iónica y pH, y la afinidad de las proteínas individuales para las biomoléculas. Sin embargo, el uso de glicoproteínas en ensayos para la medición de contenido bacteriano no ha sido descrito hasta el momento.

Se han aislado receptores de glicoproteínas en monocitos humanos. Se ha mostrado que dos proteínas de enlace extraídas de las paredes celulares de monocitos humanos tienen una afinidad de 9x10⁺⁶ para enlazar fructosilisina (lisil péptidos glicados con glucosa) con 10,000 sitios de enlace activos por célula. Se piensa que estos sitios receptores de proteína pertenecen a la familia de proteínas de enlace ARN y que están involucradas en el proceso de envejecimiento enlazando proteínas relacionadas con la edad tales como albúmina glicada. Sin embargo, la técnica previa en receptores de glicoproteína no enseña que los receptores sobre las paredes celulares podrían ser usados para la detección de células. No se provee ningún medio para la generación de señal, por partículas de color o reacciones enzimáticas que puedan ser usadas como una medida de la cuenta o detección de células.

Las bacterias son conocidas por unirse al tejido del huésped, usualmente por adhesión de la membrana celular bacteriana a proteínas de matriz extracelulares del huésped. Se conoce que este enlace ocurre a través de varias formas de interacción, por glicoaminoglicanos, colágenos, proteínas e integrinas en su superficie. Por lo tanto, la superficie celular, incluyendo superficies bacterianas celulares, puede ser visualizada como un mosaico de moléculas capaz de enlazarse a proteínas de los tejidos del huésped como también a sitios receptores del huésped.

La interacción entre células bacterianas y glicoproteínas es generalmente conocida, pero el enlace de glicopéptidos específicos a una célula bacteriana no ha sido revelado. Ha sido descrita la adhesión celular bacteriana a proteínas de matriz extra celulares tales como fibronectina y lamina. Se mostró que este enlace ocurre entre las adhesiones celulares y grupos glicados sobre las proteínas. Se han mostrado resultados similares con proteínas de tejido conectivo y células bacterianas. Estructuras de polipéptido y carbohidrato de glicoproteínas pueden tener gran variación y las estructuras químicas de glicopéptidos y glicoproteínas son usualmente desconocidas, tales como aquellas que enlazan células bacterianas.

Se han descrito métodos para medir el enlace de glicoproteínas a células bacterianas; sin embargo, la medida de bacterias por enlace de glicopéptido o glicoproteína no ha...

1. Un método para medir el contenido bacteriano de fluidos que comprende: