METODO DE ATRAPAMIENTO E INMOVILIZACION DE ENZIMAS OXIDOREDUCTASAS Y SUS USOS.

Método de atrapamiento e inmovilización de enzimas oxidoreductasas y sus usos.

Consiste en un método nuevo de atrapamiento e inmovilización de las enzimas oxidoreductasas sobre cualquier superficie metálica o de otro material sólido, como grafito, que se basa en el uso de la mezcla de Glutaraldehído como agente de entrecruzamiento y Nafion como aditivo protector.

Los dispositivos así fabricados pueden usarse como biosensores para medir analitos de interés (fenoles, glucosa, colesterol, lactosa...), y para lograr biorreactores que se pueden usar en procesos de tratamiento de aguas residuales contaminadas por los fenoles a título de ejemplo, sin descartar la posibilidad de su uso en la síntesis limpia

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200702165.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE CADIZ (DIEGO SALES MARQUEZ).

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: CÁDIZ.

Inventor/es: HIDALGO HIDALGO DE CISNEROS,JOSE LUIS, NARANJO RODRIGUEZ,IGNACIO, EL KAOULT,MOHAMMED.

Fecha de Solicitud: 2 de Agosto de 2007.

Fecha de Publicación: 8 de Febrero de 2010.

Fecha de Concesión: 26 de Enero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12N11/04 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 11/00 Enzimas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Células microbianas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Su preparación. › atrapadas en el interior del soporte, p. ej. en un gel o en fibras huecas.
C12N11/08 C12N 11/00 […] › siendo el soporte un polímero sintético.
C12Q1/26 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una oxidorreductasa.
G01N33/02 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › alimentación.
G01N33/18D
G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
H01M8/16 ELECTRICIDAD. › H01 ELEMENTOS ELECTRICOS BASICOS. › H01M PROCEDIMIENTOS O MEDIOS, p. ej. BATERÍAS, PARA LA CONVERSION DIRECTA DE LA ENERGIA QUIMICA EN ENERGIA ELECTRICA. › H01M 8/00 Pilas de combustible; Su fabricación. › Pilas de combustible bioquímicas, es decir, pilas en las que los microorganismos actúan como catalizadores.

Clasificación PCT:

C12N11/04 C12N 11/00 […] › atrapadas en el interior del soporte, p. ej. en un gel o en fibras huecas.
C12N11/08 C12N 11/00 […] › siendo el soporte un polímero sintético.
C12Q1/26 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una oxidorreductasa.
G01N33/02 G01N 33/00 […] › alimentación.
G01N33/18 G01N 33/00 […] › agua.
G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
H01M8/16 H01M 8/00 […] › Pilas de combustible bioquímicas, es decir, pilas en las que los microorganismos actúan como catalizadores.

METODO DE ATRAPAMIENTO E INMOVILIZACION DE ENZIMAS OXIDOREDUCTASAS Y SUS USOS.

Descripción:

Método de atrapamiento e inmovilización de enzimas oxidoreductasas y sus usos.

Sector de la técnica

La presente invención describe:

1- Un método nuevo de atrapamiento e inmovilización de las enzimas oxidoreductasas sobre cualquier superficie metálica o de otro material sólido, como grafito.

2- Los dispositivos así fabricados pueden usarse como biosensores para medir analitos de interés (fenoles, glucosa, colesterol, lactosa...), y para lograr biorreactores que se pueden usar en procesos de tratamiento de aguas residuales contaminadas por los fenoles a titulo de ejemplo, sin descartar la posibilidad de su uso en la síntesis limpia.

Estado anterior a la técnica

Generalmente las técnicas de inmovilización de enzimas en la superficie de un metal o material sólido pueden ser clasificadas en dos tipos:

? Física, en la cual podemos incluir: la absorción, que implica enlaces de tipo débil o interacciones electrostáticas; el atrapamiento, debido a la estructura permeable de algunas matrices de inmovilización; la encapsulación, favorecida por el carácter híbrido de algunas resinas que ofrecen entornos favorables a las enzimas.

? Química, por medio de enlaces covalentes entre la enzima y el electrodo, gracias a un agente químico que actúa como puente entre ambas partes, o por medio de entrecruzamiento cuando se trata de un agente químico que actúa no sólo para enlazar las enzimas con la superficie sólida sino también para entrecruzar las enzimas entre sí.

La presente invención está basada en la sinergia de dos de las técnicas citadas, el entrecruzamiento y la encapsulación. Por primera vez se hace uso de una mezcla de glutaraldehido y de Nafion para inmovilizar enzimas en superficies sólidas.

En la bibliografía aparecida hasta ahora, el glutaraldehido se suele usar, por su carácter bifuncional, para crear enlaces intermoleculares entre las enzimas, lo cual conduce a un capa estable y previene la lixiviación de las mismas por el medio de reacción. Esta estrategia conduce también a interacciones entre las enzimas y a una desnaturalización de esas sustancias, lo que provoca una drástica disminución de su actividad biocatalítica. Por otro lado, el uso del Nafion en una matriz de atrapamiento de las enzimas está basado en dos razones: su efecto protector frente a algunos interferentes o inhibidores, gracias a su carga negativa que se debe a la existencia de grupos sulfonados en su estructura (Nistor, et al. Anal. Chim. Acta 387, pp. 309-326); y su carácter híbrido (hidrofóbico-hidrofílico), por el cual cuando se usa mezclado por ejemplo con sol-gel, conduce a un material orgánico-inorgánico previniendo el agrietamiento del biomaterial final (Kim, et al. Anal. Chim. Acta 479, pp. 143-150; Choi, et al. Anal. Chim. Acta 537, pp. 179-187). A pesar de la abundancia de los trabajos que usan esos dos materiales para fabricar biosensores o biorreactores, el uso de esos dos agentes conjuntamente para lograr una matriz estable de atrapamiento nunca fue comunicado.

Explicación de la invención

La novedad principal del método desarrollado consiste en el uso por primera vez de una mezcla de glutaraldehido como agente de entrecruzamiento y de Nafion como aditivo protector, para lograr una matriz de atrapamiento de las enzimas.

Las ventajas que presenta la matriz aquí desarrollada sobre las preparadas de forma habitual son varias e importantes y se pueden explicar mediante la comparación de los tres esquemas abajo desarrollados:

A diferencia de los dos métodos corrientes de uso del glutaraldehido para entrecruzar las enzimas, como se muestra en la Figura 1, o para encapsularlas en los sitios hidrofilicos del Nafion, como se muestra en la Figura 2, el método aquí desarrollado aprovecha las ventajas de las dos matrices, como queda recogido en la Figura 3.

En esta nueva matriz el glutaraldehido además de actuar como agente de enlace entre los grupos funcionales de las enzimas entre sí y de las enzimas con la superficie metálica, enlaza la parte hidrofóbica en la estructura del Nafion con la superficie del metal. Esto impide el desplome de las enzimas y del Nafion.

Por su parte, el Nafion ofrece entornos muy favorables a la enzima gracias a la encapsulación de dichas sustancias en su parte hidrofílica.

Esta matriz fue desarrollada y probada en medios muy agresivos que contienen, además de inhibidores de las enzimas, un gran porcentaje de alcohol, y los resultados obtenidos demostraron una gran estabilidad de la actividad de las enzimas, sobre todo cuando se comparan con los obtenidos mediante el uso único de uno de los dos agentes.

Además, los biosensores amperométricos fabricados gracias al atrapamiento de las enzimas en esta matriz han mostrado una gran sensibilidad a los sustratos de interés o al intercambio de la carga eléctrica directa entre las enzimas y la superficie metálica, lo cual significa que la matriz aquí desarrollada además de ofrecer estabilidad a las enzimas les concede una libre movilidad y desde luego una gran actividad biocatalítica.

Modo de realización de la invención

a) Aparatos, materiales y reactivos

Para modificar biológicamente las superficies metálicas se usaron:

Las enzimas lacasa, peroxidasa y tirosinasa, suministradas por las casas Fluka o/y Sigma-Aldrisch.

El Glutaraldehido y el Nafion de concentración 25% y 5%, respectivamente, fueron suministrados por Sigma-Aldrisch.

b) Procedimiento de preparación de los biosensores

La funcionalización biológica de las superficies metálicas se llevó a cabo en varias etapas:

1- En primer lugar se limpia la superficie metálica mediante un alisado con papel de silicio, en el caso de biosensores se procede a una limpieza electroquímica mediante polarización a potencial variable en una celda de tres electrodos aplicando varios ciclos voltamperométricos.

2- Se limpia la superficie con agua y se deja secar, mientras se disuelve la enzima en la disolución reguladora adecuada; a esta disolución se le añade el Glutaraldehido y se somete a polimerización en un baño de ultrasonidos, se le añade el Nafion y se mezcla manualmente.

3- De esta disolución se toma la cantidad adecuada mediante una microjeringa, se deposita sobre el electrodo y se deja secar a temperatura ambiente. Finalmente la proporción másica del Glutaraldehido y el Nafion se optimiza en 1% y 0.5% de volumen depositado, respectivamente.

4- Pasadas ocho horas, se introduce el biosensor o el biorreactor, ya finalizado su proceso de fabricación, en una disolución reguladora bien agitada y se deja ahí durante 15 min para eliminar los restos de enzima no inmovilizadas en la superficie.

5- Una vez terminado este proceso se saca, se lava suavemente con la misma disolución reguladora y se guarda sumergido en la misma disolución en frigorífico a 4ºC cuando no está en uso.

Breve descripción de las figuras

Figura 1.- Se muestra el uso de Glutaraldehido como agente de entrecruzamiento de enzimas.

Figura 2.- Se muestra el uso de Nafion como agente de protección por encapsulamiento de las enzimas.

Figura 3.- Se muestra el uso de la mezcla de Glutaraldehido y Nafion, como método de atrapamiento e inmovilización de enzimas oxidoreductasas.

Manera en que la invención es susceptible de aplicación industrial

El método de atrapamiento aquí desarrollado es susceptible de aplicación industrial ya que puede adaptarse perfectamente para el atrapamiento de varias sustancias biológicas. Lo cual puede conducir a dispositivos de medida in situ y/o en tiempo real de analitos de interés en muestras agroalimentarias, medioambientales y clínicas. Además, dada la gran estabilidad de la matriz, incluso en medios orgánicos y de gran agresividad para las enzimas, este método de atrapamiento puede ser perfectamente utilizado en la fabricación de biorreactores.

Reivindicaciones:

1. Método de atrapamiento e inmovilización de enzimas oxidoreductasas caracterizado por el uso de la mezcla de Glutaraldehido como agente de entrecruzamiento y Nafion como aditivo protector.

2. Método de atrapamiento e inmovilización de enzimas oxidoreductasas, según reivindicación 1, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: Adición, sobre una disolución de la enzima en disolución reguladora, de la cantidad adecuada de Glutaraldehido y polimerización en baño de ultrasonidos; adición de Nafion en la cantidad adecuada y homogeneización; deposición mediante microjeringa de la cantidad requerida de esta disolución sobre la superficie del transductor.

3. Uso del método de atrapamiento e inmovilización de enzimas oxidoreductasas, según reivindicaciones 1 y 2, para la fabricación de dispositivos de medida in situ y/o en tiempo real de analitos de interés en muestras agroalimentarias, medioambientales y clínicas.

4. Uso del método de atrapamiento e inmovilización de enzimas oxidoreductasas, según reivindicaciones 1 y 2, en la fabricación de biorreactores basados en la inmovilización de sustancias bio-catalizadoras mediante la mezcla Glutaraldehido-Nafion.

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