Macrólidos polienos metilados, procedimiento para su obtención y sus aplicaciones.

Procedimiento de obtención de dos nuevos polienos rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) mediante manipulación genética del cluster implicado en la biosíntesis de los dos antibióticos macrólidos polienos rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb), los cuales presentan propiedades farmacológicas claramente mejoradas respecto a los tetraenos nativos.

La ventaja farmacológica de los polienos metilados de la invención rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) está basada en una mayor toxicidad selectiva hacia membranas que contienen ergosterol, bien hongos o parásitos, que hacia membranas celulares humanas, lo que reduce notablemente su toxicidad.

Otro objeto adicional de la invención lo constituye el uso de una composición biocida que contiene el compuesto de la invención para el tratamiento de enfermedades infecciosas en el campo sanitario humano y animal, agrario y alimentario

Macrólidos polienos metilados, procedimiento para su obtención y sus aplicaciones.

Campo de la invención

La invención se relaciona con dos polienos metilados, el procedimiento para su obtención, caracterización de actividades biológicas y posibles aplicaciones, por ejemplo terapéuticas, agrícolas y agroalimentarias.

Antecedentes de la invención

El tratamiento de infecciones fúngicas ha cobrado especial interés en los últimos años debido al aumento de pacientes inmunodeprimidos. Sin embargo, la disponibilidad de fármacos en el mercado para combatir infecciones sistémicas causadas por hongos es altamente escasa, siendo dos los grupos de fármacos comúnmente utilizados como agentes terapéuticos: azoles y polienos.

Los antifúngicos del grupo de los azoles (cuya diana es el metabolismo de lípidos de los microorganismos patógenos), aunque son eficaces en la mayoría de las infecciones fúngicas, su utilización, a veces, se ve restringida por la aparición frecuente de patógenos resistentes que invalidan su uso. Por el contrario, en el grupo de los polienos (cuya diana es la integridad funcional de la membrana de los microorganismos patógenos) la aparición de formas resistentes es muy escasa, aunque adolecen de una alta toxicidad debido a interacciones con las membranas de las células de mamíferos sometidas a tratamiento. Los inconvenientes en uno y otro grupo ha motivado que la disponibilidad de agentes antifúngicos es peligrosamente escasa y se hace necesario ampliar el número de estos agentes terapéuticos disponibles.

En términos generales, los polienos son un grupo de macrólidos policetónicos muy interesantes debido a su actividad antifúngica. Contienen un anillo de macrolactona con varios dobles enlaces conjugados, formando cromóforos con un espectro característico en la zona del ultravioleta/visible que es dependiente del número de dobles enlaces conjugados; estas características son las responsables de sus propiedades físicas y químicas (gran absorción de luz, fotolabilidad y escasa solubilidad en agua). A pesar de la importancia de algunos macrólidos poliénicos tales como la anfotericina B como fármacos antifúngicos, su mecanismo de acción preciso no se entiende bien todavía; no obstante, la actividad antifúngica parece deberse a interacciones entre las moléculas de polieno y las membranas que contienen esterol. Esta interacción proporciona un canal de iones y las membranas se hacen permeables causando la destrucción de gradientes electroquímicos y la consecuente muerte celular. Estos compuestos muestran una afinidad significativamente mayor a las membranas que contienen ergosterol (el principal esterol presente en las membranas de hongos y algunos parásitos como Trypanosoma y Leishmania) que a las membranas que contienen colesterol (células de mamíferos). Sin embargo, la interacción entre los polienos y las membranas que contienen colesterol no es insignificante y ello es la causa de efectos secundarios, lo que unido a la baja solubilidad, hace que el compuesto no sea totalmente satisfactorio para tratar infecciones sistémicas fúngicas. A pesar de estas propiedades indeseables y los efectos secundarios tóxicos de la anfotericina B, este antiguo fármaco ha sido empleado durante más de 40 años y sigue siendo el agente antifúngico preferido para tratar la mayoría de las infecciones sistémicas; de hecho, se admite que no hay mejores alternativas disponibles para luchar contra las enfermedades fúngicas emergentes. Algunos de los efectos indeseables pueden minimizarse mediante la liberación del fármaco en una formulación liposomal; ésto reduce la toxicidad de la anfotericina B y ha permitido su aplicación sistémica como antifúngico (micosis) y como antiparasitario (ej., frente a leishmaniasis y trypanosomiasis, entre otras infecciones), organismos cuyas membranas celulares contienen ergosterol (Berman et al., 1992, Antimicrob. Agents Chemother 36:1978-1980; Herwaldt, (1999), The Lancet. 354: 1191-1199; Yardley et al., 1999, Am. J. Trop. Med. Hyg. 61: 163-197).

Por esta razón, el descubrimiento de nuevos fármacos antifúngicos o la mejora de las propiedades farmacológicas de los ya existentes constituye un reto apasionante. Con este objetivo, y empleando aproximaciones racionales de modelos moleculares, se han generado y ensayado varios derivados semi-sintéticos de anfotericina B como fármacos antifúngicos eficaces. Para efectuar las modificaciones estructurales se han considerado, entre otros, dos blancos principales: el grupo carboxílico de la cadena lateral y el grupo amino del azúcar. Aunque algunos de estos derivados semi-sintéticos todavía mostraban la misma toxicidad, otros presentaban características farmacológicas mejoradas comparadas con la molécula de anfotericina B: mayor actividad antifúngica, mayor solubilidad en agua, mayor especificidad por membranas que contienen ergosterol y menor actividad hemolítica, lo que sugería una mayor especificidad por las membranas que contienen ergosterol. Aunque la mayor actividad antifúngica le confiere alguna ventaja a estos compuestos, sorprendentemente estas modificaciones estructurales no están comúnmente representadas dentro de los polienos naturales aislados procedentes de microorganismos. De hecho, todos los polienos descritos hasta la fecha como fármacos mejorados son derivados semi-sintéticos, generados por síntesis orgánica en lugar de por biotranformaciones.

Recientemente se han descrito nuevos polienos amidados sintetizados, de forma natural, por manipulación genética de Streptomyces diastaticus var. 108 (Seco et al., 2005, Chem. Biol. 12: 535-543). Los compuestos [rimocidina B y CE-108B] se caracterizan por una actividad fungicida alta, mayor solubilidad en agua y reducida citotoxicidad. Ambos polienos amidados fueron obtenidos al transformar la cepa silvestre S. diastaticus var. 108 con vectores derivados de SCP2* que portan el gen de resistencia a eritromicina (ermE) (Seco et al., 2005, Chem. Biol. 12:535-543). La tecnología de DNA recombinante y la disponibilidad de los genes biosintéticos de antibióticos permiten abordar manipulaciones genéticas y obtener compuestos naturales que habitualmente no son producidos por los microorganismos parentales. Este planteamiento nos ha llevado a abordar la obtención de nuevos macrólidos polienos por manipulación de genes biosintéticos de los antibióticos rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) producidos por S. diastaticus var. 108 (Seco et al. 2004, Chem. Biol. 11:357-366).

Compendio de la invención

En esta invención se describe la obtención de dos nuevos polienos rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) mediante manipulación genética del cluster implicado en la biosíntesis de los dos antibióticos macrólidos polienos rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) (Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366), los cuales presentan propiedades I farmacológicas claramente mejoradas respecto a los tetraenos nativos.

En base al modelo propuesto para la biosíntesis de los tetraenos nativos rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) (Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366), en el módulo 7 de la poliquétido sintetasa (PKS) se incorpora metilmalonamil-CoA como unidad de elongación, que es responsable de la presencia de un grupo metilo en el anillo macrocíclico que, posteriormente, mediante una modificación post-PKS específica de sitio se oxidaría para dar lugar al grupo carboxilo libre presente en rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb). Está descrito que una citocromo P450 monooxigenasa esté implicada en esta oxidación, y se encuentra codificada en los clusters biosintéticos de polienos descritos hasta el momento (Aparicio et al., 2003, Appl Microbiol Biotechnol 61: 179-188). En el caso de la biosíntesis de rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb), debido a la similitud de su secuencia y a que sólo se precisa de una única citocromo P450 monooxigenasa en el modelo biosintético, se propuso que RimG fuera la citocromo P450 monooxigenasa implicada en la oxidación del grupo metilo para originar el grupo carboxilo (Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366).

Para la formación del grupo amida presente en los polienos amidados rimocidina B y CE-108B, en un principio, se propusieron dos mecanismos posibles: (a) incorporación de unidades malonamil-CoA durante el ensamblaje de la cadena policetónica en lugar de unidades metilmalonil-CoA propuestas para la formación de rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) ó (b) actividad amidotransferasa actuando una vez que el grupo metilo lateral del anillo de macrolactona es oxidado a grupo carboxilo.

Esta invención provee...

1. Un compuesto de fórmula (I)

en donde R es alquilo C₁-C₃, sus isómeros, sales o solvatos.

2. Compuestos según la reivindicación 1, seleccionados entre los compuestos identificados como rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib):

3. Una composición biocida que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, junto con un vehículo inerte.

4. Composición según la reivindicación 3, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

6. Composición según la reivindicación 5, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende, además, uno o más agentes terapéuticos.

8. Empleo de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la infección causada por organismos patógenos de humanos o animales, pertenecientes al siguiente grupo: hongos, microorganismos del género Trypanosoma y microorganismos del género Leishmania, comprendiendo todos ellos ergosterol en su membrana.

9. Empleo según la reivindicación 8, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

10. Una composición antifúngica que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos inertes.

11. Composición según la reivindicación 10, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 ú 11, que comprende, además, uno o más agentes antifúngicos.

13. Un método para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos en una planta que comprende aplicar a dicha planta, o al medio que la rodea, una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

14. Un método para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos en un fruto que comprende aplicar a dicho fruto una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

15. Un método para controlar la infección causada por un hongo capaz de desarrollarse en un preparado alimentario que comprende aplicar a dicho preparado alimentario una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

16. Procedimiento para la producción de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

17. Procedimiento según la reivindicación 16 caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) pertenece al siguiente grupo: rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

18. Un microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B (número de depósito: DSM 17482) productor de los polienos metilados de fórmula general (I) rimocidina C, CE-108C y sus mezclas.

19. Empleo de un microorganismo según la reivindicación 18 para la obtención de un compuesto de fórmula (I).

20. Empleo según la reivindicación 19 caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

21. Caldo de fermentación obtenido en el procedimiento según las reivindicaciones 16 y 17 que comprende un compuesto seleccionado entre un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

22. Procedimiento de obtención de un microorganismo según la reivindicación 18 caracterizado por que en la cepa resultante está exclusivamente bloqueada la expresión del gen rimG y por que comprende las siguientes etapas:

23. Procedimiento de obtención según la reivindicación 22 caracterizado por que la cepa resultante es la cepa S. diastaticus var. 108::PM1-768/743B y comprende las siguientes etapas: