Nuevos polienos amidados, procedimiento para su obtención y aplicaciones.

Los nuevos polienos amidados responden a la fórmula (I), donde R es NH{sub,2} y R{sub,1} es alquilo C1-C3, y tienen actividad biocida frente a organismos que poseen membranas celulares que contienen ergosterol, por ejemplo, hongos o parásitos. Estos compuestos pueden ser obtenidos mediante un procedimiento que comprende cultivar un microorganismo productor bajo condiciones que permitan su producción

Nuevos polienos amidados, procedimiento para su obtención y aplicaciones.

Campo de la invención

La invención se relaciona con nuevos polienos amidados, un procedimiento para su obtención y aplicaciones, por ejemplo, terapéuticas, agrícolas y agroalimentarias. La invención también se relaciona con microorganismos recombinantes productores de polienos amidados así como con vectores útiles para obtener dichos microorganismos.

Antecedentes de la invención

Las infecciones fúngicas representaban en el pasado un lugar poco relevante dentro del panorama de las enfermedades infecciosas. Sin embargo, ese panorama ha cambiado radicalmente en los últimos veinte años. El aumento de los pacientes inmunodeprimidos, los transplantes de médula y de órganos sólidos, el mayor número de pacientes cancerosos, los tratamientos quimioterápicos, la utilización de agentes inmunosupresores así como de agentes antimicrobianos de amplio espectro y de otros fármacos que alteran los mecanismos naturales de defensa, y la epidemia del SIDA, han sido responsables de este cambio. La infección nosocomial por especies fúngicas tiene cada vez mayor relevancia y son también más numerosas las especies fúngicas que se asocian a micosis profundas.

A pesar de la necesidad de disponer de fármacos antifúngicos, el número de estos productos farmacéuticos en el mercado para tratar infecciones sistémicas es peligrosamente bajo. La mayoría de ellos, tales como los azoles y los polienos, entre los que se encuentra la anfotericina B, tienen como diana la integridad estructural de las membranas fúngicas, si bien, en los últimos años, se han desarrollado fármacos antifúngicos (equinocandinas) que tienen como diana componentes específicos de la pared celular.

Los polienos son un grupo de macrólidos policetónicos muy interesantes debido a su actividad antifúngica. Estos compuestos contienen un anillo de macrolactona con numerosos dobles enlaces conjugados, formando cromóforos con un espectro característico en la zona del ultravioleta/visible; estas características son las responsables de sus propiedades físicas y químicas (gran absorción de luz, fotolabilidad y escasa solubilidad en agua). A pesar de la importancia de algunos ejemplos tales como la anfotericina B como fármacos antifúngicos, su mecanismo de acción preciso no se entiende bien todavía; no obstante, la actividad antifúngica parece deberse a interacciones entre las moléculas de polieno y las membranas que contienen esterol. Esta interacción proporciona un canal de iones y las membranas se hacen permeables causando la destrucción de gradientes electroquímicos y la consecuente muerte celular. Estos compuestos muestran una afinidad significativamente mayor a las membranas que contienen ergosterol (el principal esterol presente en las membranas de hongos y parásitos como Trypanosoma y Leishmania) que a las membranas que contienen colesterol (células de mamíferos). Sin embargo, la interacción entre los polienos y las membranas que contienen colesterol no es insignificante y causa efectos secundarios, lo que unido a la baja solubilidad, hace que el compuesto no sea totalmente satisfactorio para tratar infecciones sistémicas fúngicas. A pesar de estas propiedades indeseables y los efectos secundarios tóxicos de la anfotericina B, este antiguo fármaco ha sido empleado durante más de 40 años y sigue siendo el agente antifúngico preferido para tratar la mayoría de las infecciones sistémicas; de hecho, se admite que no hay mejores alternativas disponibles para luchar contra las enfermedades fúngicas emergentes. Algunos de los efectos indeseables pueden minimizarse mediante la liberación del fármaco en una formulación liposomal; ésto reduce la toxicidad de la anfotericina B y ha permitido su aplicación sistémica como antifúngico (micosis) y como antiparasitario (e.g., frente a leishmaniasis y trypanosomiasis, entre otros parásitos), organismos cuyas membranas celulares contienen ergosterol (Berman et al., 1992, Antimicrob. Agents Chemother 36:1978-1980; Herwaldt, (1999), The Lancet. 354:1191-1199; Yardley et al., 1999, Am. J. Trop. Med. Hyg. 61:163-197).

Por esta razón, el descubrimiento de nuevos fármacos antifúngicos o la mejora de las propiedades farmacológicas de los ya existentes constituye un reto apasionante. Con este objetivo, y empleando aproximaciones racionales de modelos moleculares, se han generado y ensayado varios derivados semi-sintéticos de anfotericina B como fármacos antifúngicos eficaces. Para efectuar las modificaciones estructurales se han considerado, entre otros, dos blancos principales: el grupo carboxílico de la cadena lateral y el grupo amino del azúcar. Aunque algunos de estos derivados semi-sintéticos todavía mostraban la misma toxicidad, otros presentaban características farmacológicas mejoradas comparadas con la molécula de anfotericina B: mayor actividad antifúngica, mayor solubilidad en agua, mayor especificidad por membranas que contienen ergosterol y menor actividad hemolítica, lo que sugería una mayor especificidad por las membranas que contienen ergosterol. Aunque la mayor actividad antifúngica le confiere alguna ventaja a estos compuestos, sorprendentemente estas modificaciones estructurales no están comúnmente representadas dentro de los polienos naturales aislados procedentes de microorganismos. De hecho, todos los polienos descritos hasta la fecha como fármacos mejorados son derivados semi-sintéticos, generados por síntesis orgánica en lugar de por biotransformaciones.

Aunque se dispone de diversos agentes antifúngicos no poliénicos, el uso de estos fármacos favorece la selección y desarrollo de cepas resistentes a ellos que pueden comprometer en un futuro la eficacia de esos compuestos para el tratamiento antifúngico. Existe, por tanto, un interés generalizado en la búsqueda de nuevos fármacos antifúngicos y en la mejora de las propiedades farmacológicas de los ya existentes.

Compendio de la invención

Los inventores de la invención han encontrado que mediante la manipulación genética de Streptomyces diastaticus var. 108, una cepa productora de dos antibióticos macrólidos poliénicos (rimocidina y CE-108) (Pérez-Zúñiga et al., (2004), J. Antibiot. (Tokio) 57:197-204), por transformación con vectores derivados de SCP2* que portan el gen de resistencia a eritromicina (ermE) (Uchiyama et al., (1985), Gene 38:103-110) se obtienen además de los dos polienos nativos, dos nuevos macrólidos poliénicos en el caldo de fermentación de la cepa recombinante que, una vez caracterizados químicamente, resultaron ser las amidas de los ácidos carboxílicos de los polienos de los que proceden. La actividad biológica y algunos ensayos de toxicidad in vitro mostraron que la modificación química presente en los nuevos compuestos (amida en lugar de ácido carboxílico) confiere propiedades biológicas mejoradas comparadas con las que presentan los productos de los que proceden.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con dos polienos amidados identificados más adelante en esta descripción como rimocidina B (Ia) y CE-108B (Ib); su obtención y aplicaciones constituyen aspectos adicionales de esta invención.

Dichos compuestos tienen actividad biocida, que, en particular, es más selectiva frente a organismos que tienen membranas celulares que contienen ergosterol, bien hongos o parásitos. Composiciones biocidas, por ejemplo, composiciones farmacéuticas y/o composiciones antifúngicas para uso agrícola o agroalimentario que contengan dichas amidas, constituyen un aspecto adicional de esta invención. El empleo de dichos polienos amidados en composiciones farmacéuticas con fines sanitarios para uso humano o animal y/o composiciones antifúngicas de uso agrícola o agroalimentario constituye otro aspecto de esta invención.

La invención se relaciona, en otro aspecto, con un procedimiento para la producción de dichos polienos amidados que comprende cultivar un microorganismo recombinante productor de dichos compuestos bajo condiciones que permitan la producción de dichos polienos amidados, y, si se desea, aislar y purificar dichos compuestos. Ejemplos ilustrativos de dichos microorganismos recombinantes incluyen Streptomyces diastaticus var. 108/784, Streptomyces diastaticus var. 108/743B y Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-500/743B (invención), los cuales constituyen un aspecto adicional de esta invención así como el empleo de éstos o similares microorganismos recombinantes en la obtención de dichos polienos amidados y, opcionalmente, en la obtención de mezclas de éstos...

1. Un compuesto de fórmula (I)

en donde

R es NH₂; y

R₁ es alquilo C₁-C₃

sus isómeros, sales, profármacos o solvatos.

2. Compuesto según la reivindicación 1, seleccionado entre los compuestos identificados como rimocidina B (Ia) y CE-108B (Ib):

3. Una composición biocida que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, junto con un vehículo inerte.

4. Composición según la reivindicación 3, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina B (Ia), CE-108B (Ib) y sus mezclas.

5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

6. Composición según la reivindicación 5, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina B (Ia), CE-108B (Ib) y sus mezclas.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende, además, uno o más agentes terapéuticos.

8. Empleo de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, en la elaboración de un medicamento o composición para la prevención y/o el tratamiento de la infección causada por organismos patógenos de humanos o animales, pertenecientes al siguiente grupo: hongos, microorganismos del género Trypanosoma y microorganismos del género Leishmania, comprendiendo todos ellos ergosterol en su membrana.

9. Empleo según la reivindicación 8, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina B (Ia), CE-108B (Ib) y sus mezclas.

10. Una composición antifúngica que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos inertes.

11. Composición según la reivindicación 10, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina B (Ia), CE-108B (Ib) y sus mezclas.

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 ú 11, que comprende, además, uno o más agentes antifúngicos.

13. Un método para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos en una planta que comprende aplicar a dicha planta, o al medio que la rodea, una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

14. Un método para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos en un fruto que comprende aplicar a dicho fruto una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

15. Un método para controlar la infección causada por un hongo capaz de desarrollarse en un preparado alimentario que comprende aplicar a dicho preparado alimentario una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

16. Vector identificado como pSM784 caracterizado porque se ha clonado en el sitio EcoRV del vector conocido pIJ941 el gen de resistencia a eritromicina (ermE).

17. Vector identificado como pSM743B caracterizado porque se han clonado en el sitio EcoRV del vector conocido pIJ922 los genes xysAP, rimA y ermE.

18. Un microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108/784 (número de depósito DSM 17187) útil para la producción del compuesto según fórmula (I) caracterizado porque se obtiene mediante la transformación de la cepa conocida Streptomyces diastaticus var. 108 con el vector pSM784 según la reivindicación 16.

19. Un microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108/743B útil para la producción del compuesto según fórmula (I) caracterizado porque se obtiene mediante la transformación de la cepa conocida Streptomyces diastaticus var. 108 con el vector pSM743B según la reivindicación 17.

20. Un microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-500/743B útil para la producción del compuesto según fórmula (I) caracterizado porque se obtiene mediante la transformación de la cepa conocida Streptomyces diastaticus var. 108 mediante integración del fago PM1-500 y transformación con el vector pSM743B según la reivindicación 17.

21. Empleo de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 18 a la 20 en la obtención de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1.

22. Empleo según la reivindicación 21, en el que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina B (Ia), CE-108B (Ib) y sus mezclas.

23. Empleo según la reivindicación 21 en el que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre, rimocidina (IIa), CE-108 (IIb) y sus mezclas.

24. Caldo de fermentación de un microorganismo según las reivindicaciones 18 a la 20 que comprende un compuesto seleccionado entre un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, rimocidina (IIa), CE-108 (IIb) y sus mezclas.

25. Caldo de fermentación según la reivindicación 24, en el que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina B (Ia), CE-108B (Ib) y sus mezclas.