PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE UN ALMIDON MODIFICADO.

Procedimiento para la producción de un almidón caracterizado porque se aísla el almidón a partir de células de plantas transgénicas o a partir de plantas transgénicas que contienen tales células de plantas transgénicas,

estando las células de plantas transgénicas caracterizadas porque ellas son transformadas con una molécula de ácido nucleico, que codifica una proteína, que se presenta en células de plantas tanto unida a granos de almidón como también en forma soluble, y cuya disminución en células de plantas conduce a la síntesis de un almidón con un contenido reducido de fosfato, o que al realizar una expresión en E. coli conduce a una fosforilación del glicógeno sintetizado en las células, estando la molécula de ácido nucleico seleccionada entre el conjunto que consiste en:

(a) moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada bajo Seq ID No: 2;

(b) moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden la región codificadora de la secuencia de nucleótidos indicada bajo Seq ID No: 1;

(c) moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos mencionadas bajo (a) o (b) y que codifican una proteína, que se presenta en células de plantas tanto unida a granos de almidón como también en forma soluble, y cuya disminución en células de plantas conduce a la síntesis de un almidón con un contenido reducido de fosfato, o que al realizar una expresión en E. coli conduce a una fosforilación del glicógeno sintetizado en las células;

(d) moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con (c), efectuándose la hibridación en condiciones rigurosas;

(e) moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia es idéntica en por lo menos un 60% con la región codificadora de la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 1 y que codifican una proteína, que se presenta en células de plantas tanto unida a granos de almidón como también en forma soluble, y cuya disminución en células de plantas conduce a la síntesis de un almidón con un contenido reducido de fosfato, o que al realizar una expresión en E. coli conduce a una fosforilación del glicógeno sintetizado en las células; y

(f) fragmentos de las moléculas de ácidos nucleicos mencionadas bajo (a) hasta (e), poseyendo los fragmentos una longitud suficiente como para codificar una proteína, que se presenta en células de plantas tanto unida a granos de almidón como también en forma soluble, y cuya disminución en células de plantas conduce a la síntesis de un almidón con un contenido reducido de fosfato, o que al realizar una expresión en E. coli conduce a una fosforilación del glicógeno sintetizado en las células;

estando unida esta molécula de ácido nucleico con unos elementos de ADN reguladores, que garantizan la transcripción y la traducción en células de plantas

Procedimiento para la producción de un almidón modificado.

El presente invento se refiere a unos procedimientos para la producción de un almidón, en los cuales se sintetiza un almidón a partir de plantas transgénicas o de células de tales plantas, que se habían modificado mediante moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína unida a granos de almidón.

El polisacárido almidón, que constituye una de las sustancias almacenadoras más importantes en el reino vegetal, encuentra también, junto a la utilización en el sector de los alimentos, una amplia utilización como materia prima renovable para la producción de productos industriales. Con el fin de hacer posible la utilización de esta materia prima en el mayor número posible de sectores de empleo, es necesario conseguir una gran diversidad de sustancias y una adaptación a los requisitos respectivos de la industria que las ha de elaborar.

Aún cuando un almidón está constituido por un eslabón fundamental químicamente uniforme, la glucosa, este almidón no constituye ninguna materia prima uniforme. Se trata en tal caso más bien de una compleja mezcla de diferentes formas de moléculas, que se diferencian en lo que se refiere a su grado de ramificación y a la aparición de ramificaciones de las cadenas de glucosa. Se establece diferencia en particular entre el almidón de amilosa, que es un polímero en lo esencial sin ramificar a base de moléculas de glucosa enlazadas en a-1,4, y el almidón de amilopectina, que constituye una mezcla de cadenas de glucosa fuertemente ramificadas de un modo diverso, realizándose las ramificaciones mediante la aparición de enlaces a-1,6-glicosídicos.

La estructura molecular del almidón, que es determinada en una gran parte por el grado de ramificación, la relación de amilosa a amilopectina, la longitud media de cadena así como la presencia de grupos fosfato, es decisiva para importantes propiedades funcionales del almidón o bien de sus soluciones acuosas. Como importantes propiedades funcionales se han de mencionar en este caso, por ejemplo, la solubilidad, el comportamiento de retrogradación, las propiedades de formación de películas, la viscosidad, la estabilidad del color, las propiedades de engrudamiento, es decir las propiedades de aglutinación y de adhesión, así como la estabilidad en frío. También el tamaño de los granos de almidón puede ser importante para diferentes utilizaciones. Presenta un interés especial, en particular, la producción de almidones con un alto contenido de amilosa. Además, un almidón modificado, contenido en células de plantas, puede modificar de una manera ventajosa en determinadas condiciones el comportamiento de las células de plantas. Se puede concebir por ejemplo una disminución de la descomposición del almidón durante el almacenamiento de órganos que contienen almidón, tales como p. ej. semillas o tubérculos, antes de su elaboración ulterior, p. ej. para la extracción del almidón. Asimismo, presenta interés producir almidones modificados, que conducen a que las células de plantas o los órganos vegetales, que contienen este almidón, se adecuen mejor para la elaboración ulterior, por ejemplo en la producción de "popcorn" (maíz reventón de tostar) o "corn flakes" (copos de maíz), a base de maíz, o de "pommes frites" (patatas fritas a la francesa), "chips" (patatas fritas a la inglesa) o polvos de patata, a base de patatas. Presenta un interés especial en este caso el mejoramiento de los almidones, en el aspecto de que tengan una "cold sweetening" (dulcificación en frío) disminuida, es decir una liberación disminuida de azúcares reductores (en particular de glucosa) en el caso de un prolongado almacenamiento a bajas temperaturas. Precisamente las patatas se almacenan frecuentemente a unas temperaturas de 4-8ºC, con el fin de reducir al mínimo la descomposición del almidón durante el almacenamiento. Los azúcares reductores, en particular glucosa, que se liberan en este caso conducen, por ejemplo en el caso de la producción de "pommes frites" o "chips", a indeseadas reacciones de caramelización (las denominadas reacciones de Maillard).

La adaptación de los almidones, aislables a partir de plantas, a determinadas finalidades de utilizaciones industriales se efectúa frecuentemente con ayuda de modificaciones químicas, que por regla general exigen una intensa dedicación de tiempo y gastos. Se manifiesta, por lo tanto, como deseable encontrar posibilidades de producir plantas, que sinteticen un almidón, que corresponda en cuanto a sus propiedades ya a los requisitos de la industria elaboradora.

Vías habituales para la producción de tales plantas consisten en procedimientos clásicos de cultivación y en la producción de mutantes. Así, por ejemplo, en el caso del maíz se produjo un mutante, que sintetiza un almidón con propiedades modificadas de viscosidad (documento de patente de los EE.UU. US 5.331.108), así como que establece por cultivación una especie de maíz (waxy maize = maíz ceroso), cuyo almidón consiste casi en un 100% en amilopectina (Akasuka y Nelson, J. Biol. Chem. 241 (1966), 2280-2285). Además, en el caso del maíz y de los guisantes se han descrito unos mutantes que sintetizan almidones con un alto contenido de amilosa (70% en el maíz o bien hasta 50% en guisantes). Estos mutantes no han sido caracterizados hasta ahora en el plano molecular y no permiten por consiguiente tampoco la producción de correspondientes mutantes en otras plantas que almacenan almidón.

Alternativamente, se pueden producir plantas que sintetizan un almidón con propiedades modificadas, con ayuda de procedimientos de tecnología genética. Se describió por ejemplo en múltiples casos la modificación por tecnología genética de plantas de patata, con la meta de modificar el almidón sintetizado en las plantas (véanse p. ej. los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 92/11376; WO 92/14827). Una premisa para la aplicación de procedimientos de tecnología genética es, sin embargo, la disponibilidad de secuencias de ADN, cuyos productos génicos tengan una cierta influencia sobre la síntesis del almidón, la modificación del almidón o la descomposición del almidón.

El presente invento se basa por lo tanto en la misión de poner a disposición moléculas de ácidos nucleicos y procedimientos, que hagan posible modificar plantas en el sentido de que éstas sinteticen un almidón, que se diferencie en lo que se refiere a sus propiedades físicas y/o químicas con respecto de un almidón sintetizado de una manera natural en las plantas, en particular de que tengan un almidón con alto contenido de amilosa, y que sea por consiguiente mejor apropiado para finalidades generales y/o especiales de utilización.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante la puesta a disposición de las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones de esta patente.

El presente invento describe unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada bajo Seq ID No. 2. Tales proteínas se presentan en los plástidos de células de plantas, tanto unidas a granos de almidón, como también fuera de los granos de almidón en una forma libre, es decir soluble. La actividad enzimática de tales proteínas conduce, al realizarse una expresión en el seno de E. coli, a una fosforilación aumentada del glicógeno sintetizado en las células. El peso molecular de estas proteínas se encuentra situado en el intervalo de 140-160 kd (kiloDalton), cuando se determina con ayuda de una electroforesis en SDS-gel [SDS = dodecilsulfato de sodio].

Además, el presente invento describe unas moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden una secuencia con la sucesión de nucleótidos que se indica bajo Seq No. 1, en particular la región codificadora indicada en Seq. No. 1.

Se describen asimismo unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína, que se presenta unida en parte a granos de almidón en los plástidos de células de plantas, y que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, antes mencionadas. El concepto de "hibridación" significa en este contexto una hibridación en condiciones convencionales de hibridación, preferiblemente en condiciones rigurosas, tal como se han descrito por ejemplo en la cita de Sambrook y colaboradores (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Estas moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos que...

1. Procedimiento para la producción de un almidón caracterizado porque se aísla el almidón a partir de células de plantas transgénicas o a partir de plantas transgénicas que contienen tales células de plantas transgénicas, estando las células de plantas transgénicas caracterizadas porque ellas son transformadas con una molécula de ácido nucleico, que codifica una proteína, que se presenta en células de plantas tanto unida a granos de almidón como también en forma soluble, y cuya disminución en células de plantas conduce a la síntesis de un almidón con un contenido reducido de fosfato, o que al realizar una expresión en E. coli conduce a una fosforilación del glicógeno sintetizado en las células, estando la molécula de ácido nucleico seleccionada entre el conjunto que consiste en: