PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE BIOMASA RICA EN ACIDOS GRASOS POLIINSATURADOS A PARTIR DEL CULTIVO DE UN THRAUSTOCHYTRIDO.

Procedimiento para la producción de biomasa rica en ácidos grasos poliinsaturados a partir del cultivo de un Thraustochytrido.



La presente invención trata de un procedimiento que permite el crecimiento de una cepa de Thraustochytrido bajo condiciones suficientes de nitrógeno. Para ello y mediante un sistema de control del pH del medio de cultivo, la cantidad de amonio o iones derivados del amonio consumidos por el microorganismo, que provocan una variación del pH del medio de cultivo, es reemplazada automáticamente por dicho sistema de control hasta que se equilibra de nuevo el pH del medio de cultivo, permitiendo que el crecimiento de la cepa de Thraustochytrido no se vea limitado por la fuente de amonio o iones de amonio del medio de cultivo

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200800793.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: LAS PALMAS.

Inventor/es: GANUZA TABERNA,ENEKO, IZQUIERDO LOPEZ,MARISOL.

Fecha de Solicitud: 7 de Marzo de 2008.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 7 de Octubre de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/10 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Protozoos; Sus medios de cultivo.
  • C12P7/64 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas.

Clasificación PCT:

  • C12N1/10 C12N 1/00 […] › Protozoos; Sus medios de cultivo.
  • C12P7/64 C12P 7/00 […] › Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas.
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Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la producción de biomasa rica en ácidos grasos poliinsaturados a partir del cultivo de un Thraustochytrido.

Sector de la técnica

La presente invención hace referencia a un procedimiento que permite obtener biomasa rica en ácidos grasos poliinsaturados, entre ellos el DHA, a partir del cultivo de un Thraustochytrido en condiciones suficientes de nitrógeno.

Estado de la técnica

Los ácidos grasos poliinsaturados, y más concretamente los de cadena larga como son el ácido eicosapentaenoico (22:5, n-3), el ácido docosahexaenoico (DHA; 22:6, n-3) o el ácido araquidonico (ARA; 20:4, n-3), son componentes nutricionales muy importantes para el ser humano ya que permiten prevenir afecciones cardiacas, favorecen el desarrollo neuronal, la agudeza visual, etc... En definitiva estos ácidos grasos poliinsaturados mejoran la calidad de vida del ser humano ya que afectan positivamente a la salud del mismo. Asimismo estos ácidos grasos forman parte de la dieta de distintos animales de cultivo a los cuales este nutriente les ayuda mejorando su crecimiento y salud.

Actualmente el DHA y el ARA se producen comercialmente a partir de microorganismos tales como el Crypthecodinium cohnii y la Mortierella alpina (Wynn y Ratledge 2007).

El schizochytrium es una especie del género Thraustochytrido capaz de producir un alto porcentaje de ácidos grasos poliinsaturados, como el DHA (35-40%). Sin embargo el uso de este microorganismo como fuente de DHA está limitado por sus altos costes de producción en relación con los precios actuales de los ácidos grasos procedentes del pescado.

Actualmente la obtención de DHA a partir de schizochytrium, mediante procesos industriales, se lleva a cabo en medios de cultivo por lotes bajo condiciones limitantes de nitrógeno, consiguiendo una biomasa final de aproximadamente 80 g/l que puede alcanzar un nivel de ácidos poliinsaturados entre el 30-40% de los ácidos grasos totales.

Este nuevo procedimiento, que se pretende proteger, induce el crecimiento de una cepa de Thraustochytrido bajo condiciones suficientes de nitrógeno, es decir, la fuente de nitrógeno del medio de cultivo estará siempre presente para el crecimiento de dicha cepa, estando dicho crecimiento limitado por otras variables distintas. Este procedimiento permite aumentar la producción de biomasa con un contenido aceptable de DHA, siendo la tasa de crecimiento dos veces mayor que la habitualmente conseguida mediante otros procedimientos. Así mismo, al contrario de lo aceptado, en condiciones suficientes de nitrógeno el procedimiento permite acumular al menos el 20% peso seco de ácidos grasos totales.

Por lo tanto la ventaja técnica aportada por este nuevo procedimiento es el aumento de la producción de biomasa rica en DHA y por consiguiente la reducción de costes de producción en los procesos industriales.

Explicación de la invención

La presente invención trata de un procedimiento que permite el crecimiento de una cepa de Thraustochytrido bajo condiciones suficientes de nitrógeno. Para ello y mediante un sistema de control del pH del medio de cultivo, la cantidad de amonio consumidos por el microorganismo, que provocan una variación del pH del medio de cultivo, es reemplazada automáticamente por dicho sistema de control hasta que se equilibra de nuevo el pH del medio de cultivo, permitiendo que el crecimiento de la cepa de Thraustochytrido no se vea limitado por la fuente de amonio del medio de cultivo.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra la influencia de la concentración inicial de glucosa sobre el crecimiento del schizochytrium en un medio de cultivo en matraces de agitación. Los datos representados son el valor promedio de tres cultivos replicados.

La figura 2 muestra los valores típicos de producción de biomasa, glucosa residual y adición de agua de amonio en una fermentación de schizochytrium.

La Figura 3 muestra los valores típicos de amonio residual y el porcentaje de ácidos grasos totales producidos en una fermentación de schizochytrium.

La Figura 4 muestra los valores típicos de producción de DHA y ácidos grasos totales en una fermentación de schizochytrium.

Modo de realización preferente de la invención

Aunque la invención se describe en términos de una realización específica preferida, será fácilmente evidente para los expertos en esta técnica que se pueden hacer diversas modificaciones, redisposiciones y reemplazos. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas a la misma.

Con el fin de demostrar mejor las características de la invención, se describe a continuación, a título de ejemplo y sin carácter limitativo, un modo de realización preferido.

En primer lugar, se elaboró un medio de cultivo, según se muestra en la tabla siguiente, en el cuál se inoculó un inoculo de una cepa de schizochytrium para definir el rango de concentraciones óptimas tanto de glucosa como de amonio que permitían un crecimiento óptimo para el schizochytrium.


Para ello se realizaron varios experimentos en matraces en agitación utilizando como fuente de nitrógeno el diamonio de tartrarto y como fuente de carbono el glutamato de sodio, de esta manera se evaluaron tanto el rango de concentraciones óptimo para el ammonio como la tolerancia a la glucosa, respectivamente. El glutamato de sodio permitió mantener el pH del medio constante, aproximadamente entre 6.8-6.9 durante todo el crecimiento, permitiendo comparar los distintos tratamientos en matraces.

A raíz de los experimentos realizados en matraces se determino que el schizochytrium crece adecuadamente en concentraciones de amonio tan altas como 13.2 g/l (2.4 gNH4/l), Si bien el pH del medio disminuyó a 4 (ver tabla 1). El descenso del pH no se pudo controlar incluso después de amortiguar el medio con 0.25 MOPS. El diammonio de tartrato fue empleado en vez del (NH4)2SO4 para evitar un gran descenso del pH, sin embargo el bajo pH no afectó al crecimiento, indicando la idoneidad de este nutriente para su empleo en el pH-auxostato.


La concentración máxima de glucosa que permitió un crecimiento óptimo estuvo entre 100 y 200 g/l, como se muestra en la figura 1. La inclusión en el medio de glutamato sódico (3 g/l) como única fuente de nitrógeno permitió mantener el pH estable.

Una vez determinadas las concentraciones máximas de glucosa y amonio (150 g/l y 2.4 g/l) toleradas por schizochytrium se diseñó el sistema de fermentación a emplear en la producción de este microorganismo, basado en el control del pH.

El procedimiento consiste en el suministro automático de amonio en respuesta a la variación de pH que el consumo de este nutriente, por parte del organismo, causa en el medio de cultivo. Se utiliza por tanto el sistema de control del pH del fermentador para mantener la concentración de amonio dentro del rango óptimo para el organismo, de tal forma que el crecimiento del mismo no se ve limitado por la fuente de nitrógeno.

Mediante el control del pH del medio de cultivo, el fermentador añadió automáticamente 135 ml/9.5% (w/v) de NH4OH a lo largo de 49 horas, proporcionando una conversión de aproximadamente 10 gPCS/gNH3 (PCS hace referencia a peso celular seco), como se muestra en la figura 2. De esta forma se mantuvieron las concentraciones óptimas de amonio y un pH de 7. La adición de NH4OH al medio de cultivo permitió que el crecimiento del organismo se llevara a cabo bajo condiciones suficientes de nitrógeno, consiguiéndose un cultivo de alta densidad celular.

La fermentación se llevó a cabo en un medio de cultivo que comprendía de una lista de elementos al menos los siguientes:



 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la producción de biomasa a partir de una cepa del género Thraustochytrido, entre ellos la especie schizochytrium, que acumula ácidos grasos, entre ellos el DHA, que comprende las siguientes fases:

a) Cultivo de una cepa del género Thraustochytrido, entre ellos el schizochytrium, en un medio de cultivo acuoso que comprende al menos un componente seleccionado de una lista de nutrientes en la que se encuentra el amonio como fuente primaria de nitrógeno para la producción de biomasa rica en DHA.

b) Empleo de un sistema de control del pH para regular el suministro de amonio al medio de cultivo en respuesta a la variaciones del pH del medio de cultivo como consecuencia del consumo de amonio del medio de cultivo por parte del microorganismo y manteniendo así condiciones suficientes de amonio en el medio de cultivo.

c) Recuperación de biomasa y ácidos grasos, incluido el DHA, a partir de la especie de Thraustochytrido seleccionada.

2. Procedimiento según reivindicación 1, donde el suministro de amonio permite que el crecimiento del Thraustochytrido se lleve a cabo en condiciones suficientes de nitrógeno.

3. Procedimiento según reivindicación 1, donde el sistema de control de pH del medio de cultivo se realiza suministrando amonio como solución correctora básica.

4. Procedimiento según reivindicación 1, donde la cantidad de amonio añadida al medio de cultivo será tal que mantenga el pH del medio entre 4 y 9, siendo preferible 7.

5. Procedimiento según reivindicación 4, donde se pueden llevar a cabo adiciones de otros componentes del medio de cultivo además del amonio.

6. Procedimiento según reivindicación 4, donde la adición de amonio controla la adición de otros componentes del medio de cultivo, encontrándose el resto de los componentes del cultivo en la solución junto con el amonio, donde el amonio domina el pH de dicha solución. La adición de amonio, por tanto, vendrá asociada a la adición del resto de componentes en la solución.

7. Procedimiento según reivindicación 4, donde la solución que incluye amonio a su vez puede incluir una fuente de carbono, una fuente de fósforo, al menos un aminoácido, al menos una vitamina, al menos una sal, al menos un lípido y al menos un factor de crecimiento.

8. Procedimiento según reivindicación 1, donde el medio de cultivo en el que se inocula la cepa contiene una concentración inicial de glucosa mayor que 20 g/l, preferiblemente 150 g/l.

9. Procedimiento según reivindicación 1, donde la concentración inicial de amonio en el medio de cultivo está entre 0.1-16 g/l, preferiblemente 1.6 g/l.

10. Procedimiento según reivindicación 1, donde la cantidad de amonio suministrada es menor que la demanda generada por el cultivo, de tal forma que controla pero no limita el crecimiento del organismo.


 

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