LA FUNCION DE UN RECEPTOR DE HAPTOGLOBINA-HEMOGLOBINA Y LOS USOS DEL MISMO.

Un compuesto que es (i) un complejo de Hp-Hb o un fragmento del mismo que comprende la cadena pesada (ß) de haptoglobina o (ii) un anticuerpo o un fragmento del mismo,

en el que el complejo de Hp-Hb o el fragmento del mismo o el anticuerpo o el fragmento del mismo es capaz de unirse a un receptor CD163, para su uso en el suministro terapéutico de un medicamento a células presentadoras de CD163

La función de un receptor de haptoglobina-hemoglobina y los usos del mismo.

La presente invención se refiere a un complejo de haptoglobina-hemoglobina (Hp-Hb) o una parte del mismo o un mimético del mismo que está unido operativamente a una sustancia y que es capaz de unirse a un receptor CD163. Además, la invención se refiere a una variante de CD163, unida a membrana o soluble, capaz de unirse a al menos un complejo de haptoglobina-hemoglobina (Hp-Hb) y al uso del complejo de Hp-Hb y el receptor CD163 para terapia.

Antecedentes de la invención

La hemoglobina normal del adulto está constituida por un tetrámero de cuatro cadenas de hemoglobina, dos cadenas a y dos cadenas ß. El O₂ se une a la forma tetramérica de la hemoglobina y se transporta en la sangre. La sangre fetal comprende hemoglobina fetal, un tetrámero que está constituido por dos cadenas a y dos cadenas ?. Se han identificado otras cadenas de hemoglobina, tales como cadenas d, cadenas e, cadenas zeta, cadenas t o la forma S que se sabe que es la mutación observada en hemoglobina de individuos que padecen anemia de células falciformes.

La lisis intravascular de glóbulos rojos (hemólisis) conduce a la liberación de hemoglobina al plasma. Este fenómeno tiene lugar durante estados fisiológicos así como patológicos. Las complicaciones patológicas son graves cuando se aceleran en enfermedades infecciosas (por ejemplo, malaria), hereditarias (por ejemplo, anemia de células falciformes) o autoinmunes. Los tetrámeros de hemoglobina se convierten en dímeros de hemoglobina capaces de unirse a haptoglobina. En el plasma, la hemoglobina se captura por la proteína de fase aguda haptoglobina. La haptoglobina es una proteína plasmática de la sangre que tiene un peso molecular de aproximadamente 86.000 a 400.000 y desempeña un papel importante en el metabolismo de la hemoglobina liberada al torrente sanguíneo. Cuando se libera de manera excesiva en la sangre, la hemoglobina se excreta a la orina a través de los túbulos renales, dando como resultado no solamente una pérdida de hierro, sino también trastornos de los túbulos renales. Debido a que la haptoglobina se une selectivamente y de manera estrecha a la hemoglobina in vivo y, de este modo, forma un complejo de hemoglobina-haptoglobina, tiene funciones importantes en la recuperación del hierro y en la prevención de trastornos renales.

La Hp se sintetiza como una cadena única, que se escinde después de la traducción en una cadena a amino-terminal y una cadena ß carboxi-terminal. La estructura básica de Hp, como se encuentra en la mayoría de los mamíferos, es un homodímero (Fig. 2a), en el que las dos moléculas de Hp están unidas por un único enlace disulfuro por sus respectivas cadena a de ~ 9 kDa. En el ser humano, también está presente una variante con una cadena a larga en todas las poblaciones. Esta variante surgió aparentemente por una duplicación intragénica temprana, que se origina probablemente de un entrecruzamiento desigual de dos alelos básicos, dando como resultado una Hp con una cadena a de -14 kDa. Las cadenas a corta y larga se denominan a¹ y a², respectivamente. Ya que la cisteína que forma el enlace disulfuro intermolecular entre las cadenas a también está duplicada, los seres humanos que llevan el alelo de la variante larga muestran un fenotipo de Hp multimérico (Fig. 2a).

Las haptoglobinas humanas convencionales se han estudiado bien; se descubrieron hace más de 40 años y se piensa que su papel está en el transporte plasmático de hemoglobina libre. Adicionalmente, se piensa que la haptoglobina tiene actividades anti-inflamatorias, tales como su efecto decreciente sobre el metabolismo de los neutrófilos, y un efecto sobre el sistema inmune posiblemente modulando la proliferación de células B y disminución de la producción de anticuerpos. Los mecanismos de la influencia de la haptoglobina sobre la función inmune se desconocen. Las potenciales rutas de señalización por las que la haptoglobina media en sus efectos y la existencia de un receptor de haptoglobina no se han descrito en la técnica anterior.

Sin embargo, Ghmati y col., 1996 describen un estudio en el que la haptoglobina es un ligando de baja afinidad alternativo para CD11b/CD18 en líneas celulares de monocitos. CD11b/CD18 es parte de la familia de las integrinas y está implicado en funciones inflamatorias e inmunológicas.

Otra molécula receptora más presente en monocitos es CD163. Se identifica como un miembro de la superfamilia rica en cisteína de receptor limpiador (SRCR) presente en células de la familia monocítica, tal como la mayoría de los macrófagos. Ritter y col., 1999 analizan la regulación, estructura del promotor y organización genómica del receptor CD163. La función precisa de CD163 no se ha descrito. Además, el trabajo previo sobre la función biológica de CD163 está limitado a un estudio sobre el efecto de la reticulación mediada por anticuerpo de CD163 sobre monocitos cultivados (Van den Heuvel, M. M y col. Regulation of CD163 on human macrophages: cross-linking of CD163 induces signalling and activation. J. Leukoc. Bil. 66, 858-866 (1999). La ligación en superficie de CD163 induce una señal dependiente de tirosina cinasa que da como resultado movilización de calcio intracelular, producción de trifosfato de inositol y secreción aumentada de citocinas anti-inflamatorias.

Sumario

Los presentes inventores han identificado CD163 como el receptor de macrófagos de alta afinidad para complejos de haptoglobina-hemoglobina. También han identificado una forma soluble de CD163 en plasma de sujetos humanos normales y han encontrado una correlación entre receptor unido a membrana y soluble. En condiciones normales, está presente aproximadamente 100-500 µg/l de CD163 soluble en el plasma. La presente invención se refiere al uso del receptor CD163, unido a membrana o soluble y/o una variante de CD163 y/o al uso de complejos de haptoglobina-hemoglobina en el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de diversas enfermedades y trastornos.

Por consiguiente, la invención describe un complejo de Hp-Hb, o una parte del mismo o un mimético del mismo que está unido operativamente a una sustancia, donde el complejo de Hp-Hb es capaz de unirse a CD163 y/o una variante de CD163. En el presente contexto, la expresión complejo de Hp-Hb incluye un equivalente funcional del mismo a menos que se indique de forma expresa de otro modo.

En el presente contexto, el término "sustancia" quiere decir un componente heterólogo al complejo de Hp-Hb, tal como un fármaco, un gen, una vesícula, un vector o similares.

Además, la invención se refiere al uso de al menos un complejo de Hp-Hb para el suministro de al menos un fármaco, o al menos un gen a una célula que expresa un receptor CD163 y/o una variante de receptor CD163. La invención también se refiere al uso de al menos un complejo de Hp-Hb, que comprende además una variante de receptor CD163 para la identificación de al menos un complejo de Hp-Hb en el suero y/o plasma de un individuo.

En el presente contexto, la expresión receptor CD163 abarca tanto el receptor limpiador convencional CD163 de monocitos y la mayoría de los macrófagos tisulares como la forma soluble de CD163, sHbSR a menos que se especifique de otro modo. El término CD163 se usa de manera sinónima con la expresión receptor CD163. El término sHbSR se usa de manera intercambiable con receptor CD163 soluble.

La expresión una variante de receptor CD163 se usa de manera sinónima con la expresión variante de CD163.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de al menos un complejo que comprende hemoglobina y haptoglobina como un marcador para una célula que expresa una variante de CD163, en el que al menos una de las moléculas de hemoglobina o haptoglobina están marcadas.

Además, un complejo de Hp-Hb, o una parte del mismo o un mimético del mismo que está unido operativamente a una sustancia, en el que el complejo de Hp-Hb es capaz de unirse a dicha molécula de CD163, también pertenece al alcance de la invención.

En el presente contexto, el término medicamento se usa con su significado normal como una composición a administrar a un individuo con propósitos profilácticos, terapéuticos y/o de diagnóstico.

Figuras

Figura 1: es una ilustración de las etapas implicadas en la unión Hp- Hb/CD163.

Figura 2: muestra ejemplos de 2a) un dímero de haptoglobina, 2b) multímeros de haptoglobina, 2c) complejos de Hp-Hb y 2d) un gel SDS-PAGE de mono-...

1. Un compuesto que es (i) un complejo de Hp-Hb o un fragmento del mismo que comprende la cadena pesada (ß) de haptoglobina o (ii) un anticuerpo o un fragmento del mismo, en el que el complejo de Hp-Hb o el fragmento del mismo o el anticuerpo o el fragmento del mismo es capaz de unirse a un receptor CD163, para su uso en el suministro terapéutico de un medicamento a células presentadoras de CD163.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el complejo está en una forma purificada.

3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el complejo está en una forma aislada.

4. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el complejo es dimérico.

5. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el complejo es multimérico.

6. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el medicamento comprende un fármaco para ser suministrado a una célula que expresa una molécula de CD163.

7. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el complejo o un fragmento del mismo que comprende la cadena pesada (ß) de haptoglobina o un anticuerpo o un fragmento del mismo es capaz de unirse a una región en uno o más de los dominios D1-D9 de SRCR del receptor CD163, en el que dichos dominios se corresponden a los siguientes aminoácidos en una secuencia de ADNc traducida con el Nº de acceso de Genbank Z22968: D1: aa 46-146, D2: aa 154-253, D3: aa 261 -360, D4: aa 368-467, D5: aa 473-572, D6: aa 578-677, D7: aa 714-814, D8: aa 819-920 y D9: aa 924-1023.

8. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el complejo de Hp-Hb o el fragmento del mismo o el anticuerpo o el fragmento del mismo se une a un medicamento.

9. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el medicamento comprende al menos un fármaco.

10. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el medicamento se selecciona de antibióticos y fármacos anticancerosos.

11. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medicamento se selecciona de fármacos anti-VIH.

12. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el medicamento comprende al menos un gen a suministrarse a una célula que expresa un receptor CD163.

13. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el gen comprende un ácido nucleico, tal como PNA, LNA, ADN o ARN.

14. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en el que el gen codifica CD163.

15. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en el que la célula es un macrófago.

16. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el medicamento comprende un anticuerpo o un antígeno.

17. Un complejo de Hp-Hb (complejo de haptoglobina-hemoglobina) o un fragmento del mismo que comprende la cadena pesada (ß) de haptoglobina que está unida a una sustancia, donde el complejo de Hp-Hb o la parte del mismo es capaz de unirse a un receptor CD163 y donde la sustancia comprende

        a.        un medicamento seleccionado de fármacos anti-VIH o

        b.        un gen que codifica CD163.

18. El complejo de Hp-Hb o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 17, en una forma purificada.

19. El complejo de Hp-Hb o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 17, en una forma aislada.

20. El complejo de Hp-Hb o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el complejo es dimérico.

21. El complejo de Hp-Hb o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el complejo es multimérico.

22. El complejo de Hp-Hb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-22, capaz de unirse a una región en uno o más de los dominios D1-D9 de SRCR del receptor CD163, en el que dichos dominios se corresponden a los siguientes aminoácidos en una secuencia de ADNc traducida con el Nº de acceso de Genbank Z22968: D1: aa 46-146, D2: aa 154-253, D3: aa 261-360, D4: aa 368-467, D5: aa 473-572, D6: aa 578-677, D7: aa 714-814, D8: aa 819-920 y D9: aa 924-1023.

23. El complejo de Hp-Hb o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el gen comprende un ácido nucleico, tal como PNA, LNA, ADN o ARN.

24. Uso de un complejo de Hp-Hb o un fragmento del mismo para la preparación de un diagnóstico en relación a un receptor CD163.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el diagnóstico es para marcar una célula que expresa una molécula CD163, en el que al menos una de las moléculas de hemoglobina o haptoglobina están marcadas.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 24 para identificar macrófagos en una muestra biológica de un individuo.

27. El uso de acuerdo con la reivindicación 24 para la detección de CD163 soluble en una muestra.

28. Un equivalente funcional de un complejo de Hp-Hb, en el que dicho equivalente es un anticuerpo o un fragmento del mismo y en el que dicho anticuerpo o un fragmento del mismo se une a un medicamento y es capaz de unirse a un receptor CD163, para el uso en un procedimiento de tratamiento en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo unido al medicamento se capta en una célula presentadora de receptor CD163.

29. Un equivalente funcional de acuerdo con la reivindicación 28, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de unirse a una región en uno o más dominios D1-D9 de SRCR del receptor CD163, en el que dichos dominios se corresponden a los siguientes aminoácidos en una secuencia de ADNc traducida con el Nº de acceso de Genbank Z22968: D1: aa 46-146, D2: aa 154-253, D3: aa 261-360, D4: aa 368-467, D5: aa 473-572, D6: aa 578-677, D7: aa 714-814, D8: aa 819-920 y D9: aa 924-1023.

30. Un equivalente funcional de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el medicamento se selecciona de un agente antimicrobiano, un fármaco anticanceroso, un fármaco anti-VIH, un medicamento contra linfomas y un antígeno.

31. Un equivalente funcional de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el medicamento es un anticuerpo.

32. Un equivalente funcional de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el anticuerpo se dirige a una diana que se desea aclarar de plasma.

33. Un equivalente funcional de acuerdo con la reivindicación 32, en el que la diana que se desea aclarar del plasma es mioglobina.

34. Un equivalente funcional de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el medicamento comprende un gen.

35. Un equivalente funcional de acuerdo con la reivindicación 34, en el que el gen comprende un ácido nucleico, tal como PNA, LNA, ADN o ARN.

36. Un equivalente funcional de acuerdo con la reivindicación 28, en el que la célula presentadora de receptor CD163 es un macrófago.