PÉPTIDOS Y USO DE LOS MISMOS PARA LA DETECCIÓN DE AISLADOS VIRALES DE PPV.

La presente invención se refiere a péptidos que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO:

1 o SEQ ID NO:2, el uso de dichos péptidos para la producción de anticuerpos anti-PPV o anti-PPV-M, y a un método para la detección e identificación de aislados de PPV en muestras obtenidas de plantas.

Péptidos y uso de los mismos para la detección de aislados virales de PPV.

Campo de la invención

La presente invención se encuadra en el campo general de la diagnosis de enfermedades virales en plantas, en concreto se refiere a péptidos y uso de los mismos para la detección de aislados de Plum pox virus (PPV) .

Antecedentes de la invención

La enfermedad de la sharka o viruela de los frutales de hueso es una enfermedad que afecta a las especies vegetales del género Prunus, causada por el virus fitopatógeno Plum pox virus (PPV) , Familia Potyviridae, Género Potyvirus (García y Cambra, 2007. Plant Viruses 1 (1) , 69-79) . Esta enfermedad viral provoca daños de importancia económica especialmente en albaricoquero, ciruelo (europeo y japonés) y melocotonero. Las pérdidas directas e indirectas asociadas a la enfermedad se han estimado en más de 10.000 millones de euros en los últimos 30 años (Cambra et al., 2006a. Bull. OEPP/EPPO Bull., 36, 254-261) .

PPV es un virus incluido en las listas de cuarentena de todos los países con una industria importante de Prunus. Se han descrito siete tipos de aislados de PPV: Dideron (D) , Marcus (M) , Recombinante entre D y M (REC) , El Amar (EA) , Cerezo (C) , Winona (W) y Turco (T) , entre los cuales los mayoritarios son D y M (OEPP/EPPO, 2004, http://www.eppo.org/QUARANTINE/virus/Plum pox virus/pm7-32 (1) %20PPV000%20web.pdf) . La biología y propiedades moleculares del virus han sido bien estudiadas y se conocen muchas funciones del genoma viral, que está secuenciado completamente (García y Cambra, 2007) .

La enfermedad de la sharka fue descrita en Bulgaria en 1932 (Atanasoff, 1932, Yearbook Univ. Sofia, Fac. Agricultura 11, 49-69) y actualmente ha sido reportada en todos los países europeos, en muchos mediterráneos y de oriente próximo y medio. El virus además, ha sido detectado y descrito en América (Chile, Canadá, EEUU y Argentina) y en algunos países asiáticos (India, Pakistán, China y Kazajstán) (García y Cambra, 2007) . El movimiento de material vegetal infectado, con o sin síntomas, ha sido y continúa siendo, la principal causa de dispersión del virus a larga distancia (Cambra et al., 2006a) . A más corta distancia el virus es transmitido de forma no persistente por diversas especies de pulgones, siendo los más importantes por su frecuencia y eficacia transmisora Myzus persicae y Aphis spiraecola (Labonne y Dallot, 2006, Bull. OEPP/EPPO Bull. 36, 267-270; Cambra et al., 2006b, Bull. OEPP/EPPO Bull. 36, 271-275) .

El control de PPV se efectúa tratando de impedir su introducción (entrada, instauración y dispersión) en zonas donde no está presente mediante sistemas de cuarentena. Cuando el virus se ha introducido en un país o zona y es técnicamente posible, se efectúan medidas de erradicación o exclusión de inoculo. En casos en los que las anteriores medidas no resulten posibles es necesario aplicar estrategias de convivencia basadas en el uso de material vegetal resistente, selección sanitaria que permita multiplicar únicamente material vegetal sano y realizar las plantaciones con material certificado como libre de PPV. Las estrategias basadas en resistencia serían las más durables y aconsejables, pero no existen fuentes de resistencia en otros Prunus, que pudieran ser transferidas de forma fácil mediante cruzamientos mejora clásica, aunque se están realizando diversos programas con esta finalidad (Capote et al., 2006. A review of Plum pox virus. Bull. OEPP/EPPO Bull. 36, 201-349) . Se están realizando esfuerzos para conseguir resistencia con la ayuda de métodos biotecnológicos (Scorza y Ravelonandro, 2006. Bull. OEPP/EPPO Bull. 36, 337-340; García y Cambra, 2007) . En todos estos procesos y estrategias de control son esenciales los métodos y protocolos de detección y diagnóstico del virus, que deben ser sensibles, específicos y fiables para garantizar resultados precisos. Además, los métodos utilizados deben tener capacidad de ser empleados a gran escala con extractos brutos de material vegetal, de forma que sean económicos y sencillos de uso.

La “European and Mediterranean Plant Protection Organization” (OEPP/EPPO) y la “International Plant Protection Convention” (IPPC) de la FAO, han recomendado distintos métodos biológicos, serológicos y moleculares para detección, diagnóstico y caracterización o identificación de PPV (OEPP/EPPO, 2004; IPPC, 2009, Annex to ISPM 27) . Los métodos serológicos recomendados en los protocolos internacionales, basados en la técnica ELISA, son los más utilizados y convenientes (López-Moya et al., 2000, Journal of Biotechnology 76, 121-136; Cambra et al., 2006c, Bull. OEPP/EPPO Bull. 36, 254-261; García y Cambra, 2007) e incluso los más precisos y específicos si son utilizados con anticuerpos monoclonales específicos (Capote et al., 2009, Internacional Microbiology 12, 1-6) .

Se han producido diferentes anticuerpos policlonales de PPV, que están disponibles comercialmente, pero suelen presentar graves problemas de especifidad; por ello, se tiende a utilizar anticuerpos monoclonales específicos (Cambra et al., 2006c) . En la cita anterior se recogen los distintos anticuerpos monoclonales específicos de PPV producidos hasta ahora. Entre ellos un anticuerpo de isotipo IgG1, Kappa, denominado 5B-IVIA, ha sido validado internacionalmente y es el único que representa a un epítopo universal de PPV pero a su vez específico del virus (Cambra et al., 1994. Bull. OEPP/EPPO Bull. 24, 569-577; Candresse et al., 1998a. Phytopathology 88, 198-204; Candresse et al., 1998b. Acta Horticulturae 472, 461-468; Cambra et al., 2006c; Capote et al., 2009) . La región de unión de este anticuerpo a la cápsida de PPV ha sido erróneamente descrita por Candresse et al., 1998b) , como asociada a las posiciones de aminoácidos 72-89 de la cápsida (CP) de PPV.

Sin embargo, en la presente invención se ha determinado con exactitud y completa precisión, la verdadera secuencia de aminoácidos del epítopo de 5B-IVIA, denominada 5B-IVIA/AMR Lab identificada como SEQ ID NO: 1, de peso molecular (MW) 2.005, 04 daltons que incluye la región restringida de unión (posición 94-100 de aminoácidos de la CP de PPV) . La secuencia de este epítopo único, presente en todos los aislados y tipos de PPV hasta ahora descritos, se ha determinado con certeza y es uno de los objetos de la presente invención junto con otras posibles aplicaciones de la misma. Su uso permitió generar anticuerpos convencionales (policlonales de antisueros “monoespecíficos” y anticuerpos monoclonales específicos) (Harlow and Lane, 1988. Antibodies: a laborator y manual. Cold Spring Harbor Laborator y , New York) y anticuerpos recombinantes de cualquier clase (Hollinger y Hudson, 2005. Nature Biotechnology 23, 1126-1136) específicos de PPV al clonar y expresar los genes de anticuerpos generados inmunizando con dicho epítopo.

Se han obtenido anticuerpos recombinantes, en el caso de PPV, únicamente frente a proteínas estructurales de aislados no transmisibles por pulgón, tipo NAT, y contra la RNA Nlb replicasa viral (proteína no estructural) (Esteban et al., 2003, Biochemical and Biophysical Research Communications 301, 167-175; Gil et al., 2004, Acta Horticulturae 657, 341-347; Gil et al., 2006, Actas de Horticultura SECH 45, 227-228) . Todavía no se ha empleado el epítopo o secuencia de aminoácidos objeto de la presente invención para producir anticuerpos recombinantes capaces de reconocer a cualquier aislado de PPV. Asimismo, el uso de esta secuencia concreta permitió generar anticuerpos monoclonales específicos, mediante la tecnología de hibridomas (Köhler y Milstein, 1975, Nature 256, 495-497) , capaces de reaccionar con aislados de PPV de cualquier tipo, ya que la secuencia de aminoácidos de 5B-IVIA/AMR Lab (SEQ ID NO: 1) objeto de la presente invención, representa una proteína conservada en todos los aislados de PPV y por lo tanto, universal en PPV.

Por otro lado, los tipos PPV-M poseen una epidemiología muy peculiar ya que se dispersan con facilidad entre cualquier especie de Prunus, causando graves daños económicos a la industria de todos los frutales de hueso y particularmente en melocotonero (especie difícilmente infectada naturalmente por otros tipos de PPV) . Los métodos de diagnóstico y caracterización o identificación de PPV-M son de gran interés para poder tomar decisiones de erradicación o supresión de inoculo ante este aislado agresivo.

Los protocolos internacionales, recomiendan métodos serológicos y moleculares para la identificación de aislados PPV-M (OEPP/EPPO,... [Seguir leyendo]

1. Péptido que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2.

2. Péptido según la reivindicación 1, donde el péptido de aminoácidos Arg-Asp-Arg-Asp comprendido en la secuencia SEQ ID NO: 1 actúa como péptido marcador.

3. Uso del péptido según la reivindicación 1 para la producción de anticuerpos anti-PPV (Plum pox virus) y anti PPV-M (Plum pox virus tipo Marcus) .

4. Uso del péptido según la reivindicación 3, donde los anticuerpos son anticuerpos policlonales.

5. Uso del péptido según la reivindicación 3, donde los anticuerpos son anticuerpos monoclonales específicos.

6. Uso del péptido según la reivindicación 3, donde los anticuerpos son anticuerpos recombinantes.

7. Vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

8. Célula hospedadora que comprende el vector de expresión según la reivindicación 7.

9. Planta transgénica que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7.

10. Método para la detección e identificación de aislados de PPV en muestras obtenidas de plantas o de artrópodos mediante el uso de anticuerpos anti-PPV o anticuerpos anti-PPV-M según las reivindicaciones 3-6.

11. Método para la detección e identificación de aislados de PPV según la reivindicación 10, donde los anticuerpos son anticuerpos policlonales.

12. Método para la detección e identificación de aislados de PPV según la reivindicación 10, donde los anticuerpos son anticuerpos monoclonales específicos.

13. Método para la detección e identificación de asilados de PPV según la reivindicación 10, donde los anticuerpos son anticuerpos recombinantes.

14. Método para la detección e identificación de aislados de PPV según la reivindicación 13, donde el péptido de aminoácidos Arg-Asp-Arg-Asp comprendido en la secuencia SEQ ID NO: 1 actúa como péptido marcador para detección inmunológica o molecular.

15. Método para la detección e identificación de aislado de PPV según cualquiera de las reivindicaciones 10-14, caracterizado porque la detección e identificación de aislados de PPV se realiza mediante técnicas inmunohistoquímicas.

16. Kit o estuche para la detección e identificación de aislados de PPV que comprende los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

17. Kit o estuche para la detección e identificación de aislados de PPV que comprende los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 3-6.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> MANUEL MILLÁN JIMÉNEZ

<120> MÉTODO DE DIAGNÓSTICO Y DETECCIÓN DE PPV

<130> P-INCI-N-10-003

<160> 6

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> aminoácido.

8. 102 de la proteína de la cápsida de PPV

<400> 1

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido de la cápside del PPV-M

<400> 2

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Upper primer RDRD1

<400> 3

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> lower primer RDRD2

<400> 4

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> upper primer BamH1

<400> 5

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Lower primer BamH2

<400> 6