Péptidos citrulinados virales y usos de los mismos.

Un péptido antigénicamente eficaz que consiste, desde el extremo amino al extremo carboxílico,

en la secuencia de aminoácidos:

G Q S X1, G Q S X2 G X3 G X4 G X5 G X6 G X7 G K G (aminoácido 19 a aminoácido 39 de la SEC ID Nº 1), en la que los aminoácidos X1-X7 se seleccionan de manera independiente entre un resto de arginina o un resto de citrulina, y al menos uno de X1-X7 es un resto de citrulina, o un fragmento funcional del mismo, siendo capaz dicho péptido antigénicamente eficaz y fragmento del mismo de unirse específicamente a anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y/o linfocitos T específicos de la artritis reumatoide.

Péptidos citrulinados virales y usos de los mismos Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos sintéticos citrulinados derivados del virus de Epstein Barr y su uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades autoinmunes, en particular, de la artritis reumatoide (AR).

Antecedentes de la técnica

En el amplio espectro de las enfermedades inflamatorias de las articulaciones, la artritis reumatoide (AR) ocupa una posición destacada. Al causar la inflamación simétrica y destructiva de las pequeñas y grandes articulaciones, la AR produce dolor y fallo de las articulaciones, que al final genera desfiguración y discapacidad.

La aparición de diversos autoanticuerpos es prueba de la existencia de AR. El más conocido es el factor reumatoide (RF), una clase de anticuerpos IgG o IgM dirigidos contra la región Fe del isotipo IgG de las inmunoglobulinas. Aproximadamente el 7-8 % de los pacientes con AR son seropositivos para RF, pero también se encuentran RF en las infecciones crónicas, enfermedades linfoproliferativas, otras enfermedades reumáticas yen aproximadamente el 2 % de los individuos sanos de edad avanzada. Por lo tanto, dada la limitada especificidad del RF hacia la AR, se han buscado otros anticuerpos más específicos. Se demostró claramente que los anticuerpos APF (factor anti- perinuclear) y AKA (anticuerpos anti-queratina) son altamente específicos de la enfermedad.

Más tarde, se encontró que los antígenos reconocidos por los anticuerpos APF y AKA son proteínas que contienen citrulina generadas después de la traducción mediante la modificación de las argininas en los restos de citrulina. Se desarrolló un ELISA usando péptidos citrulinados (CP) sintéticos derivados de lafilagrina [G. A. Schellekens et al. J. Clin. Invest. 1998, 11, 273], Para aumentar la sensibilidad del ensayo, se modificaron los CP en una estructura, el péptido citrulinado cíclico (CCP), en el que el resto de citrulina queda expuesto de manera óptima para la unión de anticuerpos [solicitud internacional W19982253], En un ensayo denominado CCP1 [G. A. Schellekens et al. Arthritis Rheum. 2, 43, 155], pudieron detectarse los anticuerpos en el 68 % de los sueros de pacientes con AR con una especificidad del 98 % con un solo CCP. Estudios recientes indican que el ensayo CCP de segunda generación, el CCP2 [J. Avouac et al. Ann. Rheum. Dis. 26, 65, 845], es muy sensible y específico, mostrando una sensibilidad del 68% (intervalo del 39 al 94%) con una especificidad del 95% (intervalo del 81 al 1%). Recientemente, se ha desarrollado un ensayo de tercera generación por INOVA [L. Lutteri et al. Clin. Chim. Acta 27, 386, 76] y se ha reivindicado como un nuevo ELISA anti-CCP más sensible que mantiene una especificidad del 98 %. Estos ensayos de ELISA se encuentran disponibles en el mercado (Euro-Diagnostica, Arnhem, Países Bajos; Axis-Shield, Dundee, Escocia; INOVA, San Diego, EE.UU.).

Además, se ha presentado una serie de solicitudes de patente, referidas a métodos basados en proteínas/péptidos citrulinados para detectar anticuerpos en pacientes con AR [US22143143, US278738, EP194619, US2714874, W297846, W2977, W2717556, EP1456662, W199928344,

W28132264],

Se han descrito diversas proteínas citrulinadas en la membrana sinovial con AR, por ejemplo, fibrina citrulinada extravascular [C. Masson-Bessiere et al. J. Immunol. 21, 166, 4177], colágeno II [H. Burkhardt et al. Eur. J. Immunol. 25, 35, 1643] y vimentina en macrófagos [E. R. Vossenaar et al. Arthritis Rheum. 24, 5, 3485]. Aunque la filagrina no se expresa en la membrana sinovial, sus derivados citrulinados se han usado para la detección de anticuerpos anti-CP [US2928885, US 7.445.93, US 6.89.72],

La AR tiene influencias tanto genéticas como ambientales, y hace tiempo que se sospecha que los virus potencian el desarrollo de la AR. Para ser candidatos para desempeñar un papel causal en la AR, los virus tienen que ser ubicuos, persistir en el organismo, mostrar tropismo directo o indirecto de las articulaciones, y ser capaces de alterar las respuestas inmunes del huésped. El virus de Epstein Barr (EBV) presenta estas características. Como resultado de ello, los posibles vínculos entre el VEB y la AR han sido objeto de investigación durante las tres últimas décadas [K. H. Costenbader et al. Artritis Res. Ther. 26, 8, 24]. Se sabe que los pacientes de AR poseen niveles elevados de anticuerpos frente a las proteínas EBV latentes y replicativas y, en particular, frente a EBNA-1 (antígeno nuclear 1 de Epstein-Barr). Además, la carga de EBV en sangre periférica de pacientes de AR es mayor que en los controles. Una serie de estudios ha arrojado luz sobre el posible papel etiológico de EBV en la sinovitis de la AR [S. Sawada et al. Autoimmun. Rev. 25, 4, 16], Estos estudios llevaron a la idea de explorar la respuesta inmune en los pacientes con AR usando el CP de origen viral. Los anticuerpos específicos de un péptido correspondiente a la secuencia de EBNA-1 (35-58) (péptido citrulinado viral 1, VCP1), que contiene citrulina en lugar de arginina, se detectaron en el 5 % de los sueros de AR y en menos del 5 % de los sueros de control de la enfermedad y normales [F. Pratesi et al. Arthritis Rheum. 26, 54, 733]. Además, los anticuerpos anti-VCP1 purificados por afinidad de sueros de AR reaccionaron con CP derivado de la filagrina, fibrinógeno desiminado y EBNA-1 recombinante desiminada. Se determinó la frecuencia de los anticuerpos anti-VCP1 en 627 muestras de suero, 3 de pacientes con AR y 327 de los controles, incluyendo enfermedades del tejido conjuntivo, artritis crónicas, y en

donantes sanos. Se encontraron anticuerpos anti-VCP1 en el 45 % de los sueros de AR frente a menos del 5 % de los controles [C. Anzilotti et al. J. Rheumatol. 26, 33, 647].

Incaprera et al. [Clin, y Exp. Rheum. 1998, 16(3), 289-294] desvelan el posible papel de EBV en la autoinmunidad sistémica del lupus eritematoso. En particular, dicho documento indica que EBNA-2 (354-373) reconoce anticuerpos IgG anti-SmD1.

Los péptidos citrulinados a base de EBNA-1 desiminada (35-58) son el objeto de la solicitud internacional W2487747, en la que se describe su uso para detectar anticuerpos en sueros con AR. Dicha solicitud también desvela que el uso del péptido antigénico múltiple [MAP; J. P. Tarn PNAS EE.UU. 1988, 85, 549], que contiene al menos 4 copias de EBNA-1 desiminada (35-58) como antígeno de recubrimiento en el ensayo inmunológico para la detección de anticuerpos, permite detectar anticuerpos en el 45 % de los sueros con AR con una especificidad del 95 %.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos sintéticos citrulinados derivados del EBV, y a su uso en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades autoinmunes, específicamente de la AR. En particular, estas secuencias se derivan de las proteínas de EBV (por ejemplo, EBNA-1, EBNA-2). Los péptidos citrulinados de acuerdo con la invención tienen una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia de la región de 32- 375 aa de la proteína EBNA-2 del EBV (Swiss-Prot P12978). Sorprendentemente, los péptidos según lo descrito en la invención y que poseen un número de restos de citrulina superior a uno demostraron ser muy adecuados para el diagnóstico específico de la AR.

Para aumentar la sensibilidad, manteniendo intacta la especificidad del ensayo, los autores de la presente invención buscaron otras secuencias desiminadas de origen viral para el conjunto de ensayos de diagnóstico de la AR. Con este fin, se han sintetizado secuencias de péptidos derivadas de proteínas de EBV con diferentes grados de sustituciones de arginina/citrulina, y se ha ensayado la reactividad en sueros de pacientes con AR (Tabla 1). Entre estos, algunas secuencias permitieron la diferenciación de los sueros con AR de los controles normales. Los mejores resultados se obtuvieron con péptidos citrulinados derivados del péptido desiminado EBNA-2 (338-358) (G QSRGQSRGRGRGRGRGRGKG). Estas secuencias y su uso en el diagnóstico y el tratamiento de trastornos autoinmunes son el objeto de la presente invención. En particular, la presente invención muestra que EBNA-2 (338-358) no citrulinado no reacciona con los sueros con AR. Por el contrario, los péptidos citrulinados de la invención muestran una mayor reactividad hacia los sueros con AR. También demuestra que la población de IgG identificadas por los péptidos de la invención se caracteriza por ser IgG anti-CP específicas de AR e IgG anti-SmD1 específicas de LES. La presente invención también ha identificado dos epítopos representados por las repeticiones Gly-Cit y, el otro, en las repeticiones Gly-GIn-Ser-Cit, siendo las posiciones más reactivas Cit-341, Cit-345 y Cit-349.

Los péptidos... [Seguir leyendo]

1. Un péptido antigénicamente eficaz que consiste, desde el extremo amino al extremo carboxílico, en la secuencia de aminoácidos:

G Q S Xi, G Q S X2 G X3 G X4 G X5 G X6 G X7 G K G (aminoácido 19 a aminoácido 39 de la SEC ID N2 1), en la que los aminoácidos X1-X7 se seleccionan de manera independiente entre un resto de arginina o un resto de citrulina, y al menos uno de X1-X7 es un resto de citrulina, o un fragmento funcional del mismo, siendo capaz dicho péptido antigénicamente eficaz y fragmento del mismo de unirse específicamente a anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y/o linfocitos T específicos de la artritis reumatoide.

2. El péptido de la reivindicación 1 que consiste en la secuencia de aminoácidos G Q S Cit G Q S Cit G X3 G Cit G X5 G X6 G X7 G K G (SEC ID N2 27), en la que los aminoácidos X3-X7 se seleccionan, de manera independiente, entre un resto de arginina o un resto de citrulina.

3. El péptido de las reivindicaciones 1 o 2 que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de GQSRGQSCitGRGRGRGRGRGKG (SEC ID N2 4), GQSRGQSRGRGCitGRGRGRGKG (SEC ID N2 6), GQSRGQSCitGRGCitGRGRGRGKG (SEC ID N2 12), GQSCitGQSCitGRGCitGRGRGRGKG (SEC ID N2 22) o G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K G (SEC ID N2 2), en las que Cit es un resto de citrulina o un fragmento funcional del mismo, siendo dicho fragmento capaz de unirse específicamente a anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y/o linfocitos T específicos de la artritis reumatoide.

4. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es de forma lineal.

5. Un péptido ramificado multimérico que consiste en múltiples péptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. El péptido ramificado multimérico de la reivindicación 5 que comprende cuatro copias idénticas del péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3.

7. El péptido ramificado multimérico de la reivindicación 6, que es (G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K G)4 K2 K p-Alanina:

G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K

G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K G-^K\

>------- (JA

G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K /

G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K G-^"'

en el que Cit es un resto de citrulina.

8. Un método para el diagnóstico de la artritis reumatoide en un sujeto, que comprende la etapa de detectar anticuerpos específicos de la enfermedad autoinmune en una muestra biológica obtenida del sujeto mediante:

- la reacción, en condiciones adecuadas, de dicha muestra biológica con al menos un péptido o péptido ramificado multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para producir un complejo;

- la detección del complejo.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la muestra biológica se hace reaccionar con al menos un péptido o péptido ramificado multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un péptido ramificado multimérico que comprende la secuencia (G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G A P G)4 K2 K |3-Alanina:

G G D N H G Cit G Cit G Cit G

G G D N H G Cit G Cit G Cit G

G G D N H G Cit G Cit G Cit G

G G D N H G Cit G Cit G Cit G

Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G

G G Cit P G A P G G Cit P G A P G

G G Cit P G A P G GGCitPGAPG

K.

K

K-----

en la que: Cit = citrulina o un fragmento funcional de la misma, siendo dicho fragmento capaz de unirse específicamente a anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y/o linfocitos T específicos de la artritis reumatoide.

1. El método de la reivindicación 9, en el que la muestra biológica se hace reaccionar con el péptido ramificado multimérico que consiste en la secuencia (G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K G)4 K2 K P-Alanina:

G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K G^_^

G Ü S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G KG-^\

G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K G^_ PA

G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K G-^

en la que Cit = citrulina o un fragmento funcional de la misma, siendo dicho fragmento capaz de unirse específicamente a anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y/o linfocitos T específicos de la artritis reumatoide, y el péptido ramificado multimérico que comprende la secuencia (G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G A P G)4 K2 K p-Alanina:

G G D N H G Cít G Cit G Cit G Cit G Cit G

G G D N H G Cít G Cit G Cit G Cit G Cit G

G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G

G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G

en la que Cit = citrulina o un fragmento funcional de específicamente a anticuerpos específicos de la artritis reumatoide.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1, que es un ensayo inmunológico.

12. Un kit para el diagnóstico de la artritis reumatoide que comprende al menos un péptido o un péptido ramificado multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un fragmento funcional del mismo, siendo dicho fragmento capaz de unirse específicamente a anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y/o linfocitos T específicos de la artritis reumatoide.

G G Cit P G AIP G- GGCitPGAPG- GGCitPGAPG- G G Cit P G A P G'

:K

\

K------ PA

la misma, siendo dicho fragmento capaz de unirse reumatoide y/o linfocitos T específicos de la artritis

13. El kit de la reivindicación 12, que comprende además el péptido ramificado multimérico que comprende la secuencia (G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G A P G)4 K2 K p-Alanina:

G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G A P G-

G G D N H G Cít G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G A P G

G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G A P G

G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G A P G

en la que Cit = citrulina o un fragmento funcional de la misma, siendo dicho fragmento capaz de unirse específicamente a anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y/o linfocitos T específicos de la artritis reumatoide.

14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable y eficaz del péptido o del péptido ramificado multimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un fragmento funcional del mismo, siendo dicho fragmento capaz de unirse específicamente a anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y/o linfocitos T específicos de la artritis reumatoide.

:K

X

K----- PA