INMUNOENSAYO PARA MEDULASINA HUMANA Y METODO DE DIAGNOSTICO DE LA ESCLEROSIS MULTIPLE.

Un método para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en sangre,

que se caracteriza por las siguientes etapas (a) y (b):

(a) una etapa de romper los leucocitos en una muestra de sangre, poniendo en contacto dicha muestra de sangre con los siguientes líquidos acuosos (i) o (ii) o con una mezcla de los líquidos acuosos (i) y (ii):

(i) un líquido acuoso, que contiene 0,05% mol o más, o 0,005% mol o menos de un soluto, que tiene una presión osmótica de 250 mmol/l.H2O (250 mOsm/kg.H2O) o menor, o un líquido acuoso que tiene una presión osmótica de 310 mmol/l.H2O (310 mOsm/kg.H2O) o mayor;

(ii) un líquido acuoso, en el que dicho líquido acuoso (ii) es una disolución acuosa de un tensioactivo; y

(b) determinar inmunológicamente el contenido en medulasina humana en dicha muestra de sangre mediante un método que comprende poner en contacto la muestra de sangre que contiene dicha medulasina humana liberada de los leucocitos rotos en dicha etapa (a) con un anticuerpo monoclonal antimedulasina humana inmovilizado sobre un vehículo insoluble en presencia de un anticuerpo monoclonal antimedulasina humana marcado para formar un complejo de sandwich, y capturar la medulasina humana sobre un complejo inmunológico marcado mediante una reacción de antígeno-anticuerpo, y después determinar la cantidad de actividad del material marcador en dicho complejo

Inmunoensayo para medulasina humana y método de diagnóstico de la esclerosis múltiple.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para medir inmunológicamente la medulasina humana en sangre y a un método para diagnosticar la esclerosis múltiple utilizando éste. Con más detalle, se refiere a un método para medir inmunológicamente la medulasina humana en sangre que incluyen una etapa de pretratar la muestra de sangre para medir con precisión el contenido en medulasina en los granulocitos en la sangre, y a un método para diagnosticar la esclerosis múltiple utilizando el contenido en medulasina en sangre.

Descripción de la técnica relacionada

La medulasina, que es un tipo de serina proteasa, aparece en granulocitos, etc., y se cree que desempeña muchos papeles importantes en el mecanismo de defensa, incluyendo la expresión de la inflamación, en particular la inflamación crónica. La cantidad de medulasina en los granulocitos aumenta en la etapa avanzada de una serie de enfermedades inflamatorias crónicas, y se normaliza en las etapas de remisión. Sin embargo, en pacientes que padecen esclerosis múltiple se observa que la cantidad de medulasina aumenta en gran medida unos pocos días antes de la etapa avanzada, y se normaliza antes de la remisión. La esclerosis múltiple se caracteriza por una lesión desmielinizada localizada en la materia blanca del sistema nervioso central y gliosis. Es una enfermedad inflamatoria grave que avanza con repetidas remisiones y agravamientos, y en muchos casos provoca la muerte en 10 a 15 años. La causa de la esclerosis múltiple aún no se ha identificado con claridad, pero se cree que esta enfermedad es un tipo de enfermedad autoinmunológica en que los autoanticuerpos atacan al tejido nervioso tras la estimulación del sistema inmunológico por un virus o una bacteria. Su diagnóstico es bastante difícil y en la actualidad se realiza mediante formación de imágenes de resonancia magnética (MRI) o similares. Sin embargo, un método como MRI requiere un equipo a gran escala y conocimientos técnicos especializados para la toma de mediciones y es costoso. Además, los métodos para ensayar el líquido de la médula ósea presentan el problema de infligir un gran dolor al paciente. A la luz de estas circunstancias, ahora se ha desarrollado un método de diagnóstico sencillo mediante el cual puede realizarse el diagnóstico de la enfermedad, puede conocerse el estado de la enfermedad y pueden suponerse sus consecuencias. Como resultado, se ha realizado un estudio de métodos para medir la actividad de la medulasina en los granulocitos en sangre, y junto con el desarrollo de un método de medición inmunológica mediante el cual puede medirse con facilidad, se ha propuesto la posibilidad de diagnosticar la esclerosis múltiple según el contenido en medulasina de los granulocitos en sangre.

Sin embargo, se ha observado el fenómeno de que, cuando se realiza la medición después de diluir la muestra de sangre con un medio acuoso en un método para medir inmunológicamente la medulasina humana, la medición se realiza sin haber llevado a cabo un tratamiento para expulsar completamente la medulasina presente en el granulocito hacia el exterior del granulocito, y la reproducibilidad de los valores medidos no es buena y da lugar a variaciones en los valores medidos. Por consiguiente, se ha deseado el desarrollo de un método para medir inmunológicamente la cantidad de medulasina humana en sangre con una buena reproducibilidad.

Con respecto a la cuestión de si la esclerosis múltiple puede diagnosticarse basándose en la cantidad de medulasina en sangre, este criterio requiere la inspección de cantidades considerables de datos clínicos. Sin embargo, hasta la fecha no ha existido este tipo de datos y, además, ha sido difícil realizar un diagnóstico preciso debido a la dificultad para obtener un valor medido preciso de medulasina en los granulocitos en sangre, debido a la gran variación de los valores medidos. Por consiguiente, el diagnóstico de la esclerosis múltiple basándose en la cantidad de medulasina en la sangre ha sido difícil.

Además, Aoki et al. (1984), Annals of Neurology, 15, 245-249, "Medullasin Activity in Granulocytes of Patients with Multiple Sclerosis", describen un método para determinar la actividad enzimática de medulasina en granulocitos maduros que son purificados, estabilizados, sonicados y analizados.

Además, Aoki et al. (1988), Clinica Chimica Acta, 178, 193-204, "Enzym Immunoassay of Medullasin in Peripheral Blood", describen un método de inmunoensayo enzimático para la determinación de la cantidad de medulasina con esferas de poliestireno revestidas con IgG antimedulasina de conejo. Según Aoki et al., los niveles de medulasina en la sangre periférica de pacientes con esclerosis múltiple son elevados.

Sumario de la invención

Comenzando a partir de Aoki et al. (1988), un problema técnico de la presente invención ha sido encontrar un método inmunológico mejorado para la determinación de la medulasina en sangre y un método mejorado para el diagnóstico de la esclerosis múltiple.

Este problema se resuelve mediante un método para medir inmunológicamente la medulasina según la reivindicación 1, y mediante un método para diagnosticar la esclerosis múltiple según la reivindicación 7.

Por consiguiente, los inventores de la presente invención han realizado investigaciones a fondo para resolver el problema descrito anteriormente. Como resultado, han descubierto que la medulasina humana en sangre puede medirse de forma precisa con una buena reproducibilidad midiendo inmunológicamente la medulasina humana utilizando anticuerpos antimedulasina humana después de romper completamente los leucocitos mediante el tratamiento de la muestra de sangre con un líquido acuoso que incluye un hemolisado o un líquido acuoso que tenga una presión osmótica específica diferente de la presión osmótica de la sangre humana.

Además, con el establecimiento de dicho método para medir de forma precisa la medulasina humana con una buena reproducibilidad, los inventores de la presente invención han advertido que el tamaño y los cambios en el contenido medido de medulasina humana en la muestra de sangre están muy relacionados con la aparición de la esclerosis múltiple y su alcance, etc. Basándose en estos descubrimiento se ha llegado a la presente invención.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en la sangre según la reivindicación 1.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método para diagnosticar la esclerosis múltiple según la reivindicación 7.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una curva de calibración para medir la medulasina humana, preparada representando gráficamente la absorbancia medida por el inmunoensayo enzimático descrito en el ejemplo 2 como una función de la concentración del antígeno.

La figura 2 es una curva de calibración para medir la medulasina humana, preparada representando gráficamente la absorbancia medida por el inmunoensayo enzimático descrito en el ejemplo 3 como una función de la concentración del antígeno.

La figura 3 muestra los valores de medulasina humana en muestras de sangre (µg/10⁸ granulocitos) representados gráficamente por separado para individuos normales, pacientes que padecen esclerosis múltiple, y pacientes que padecen enfermedades nerviosas no inflamatorias.

La figura 4 muestra los valores de medulasina humana en muestras de sangre (µg/10⁸ granulocitos) representados gráficamente por separado para hombres y mujeres que padecen esclerosis múltiple.

La figura 5 muestra los valores de medulasina humana en muestras de sangre (µg/10⁸ granulocitos) representados gráficamente por separado para pacientes que padecen esclerosis múltiple de diferentes edades.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

A continuación se describirá la invención con más detalle. Las realizaciones preferidas de la presente invención incluyen (1) y (2) a continuación.

(1) En primer lugar, se proporciona un método para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en sangre, que incluye:

(a) una etapa de romper los leucocitos en una muestra de sangre diluyendo dicha muestra de sangre con los siguientes líquidos acuosos (i) o (ii) o con una mezcla de los líquidos acuosos...

1. Un método para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en sangre, que se caracteriza por las siguientes etapas (a) y (b):

(a) una etapa de romper los leucocitos en una muestra de sangre, poniendo en contacto dicha muestra de sangre con los siguientes líquidos acuosos (i) o (ii) o con una mezcla de los líquidos acuosos (i) y (ii):

(i) un líquido acuoso, que contiene 0,05% mol o más, o 0,005% mol o menos de un soluto, que tiene una presión osmótica de 250 mmol/l•H₂O (250 mOsm/kg•H₂O) o menor, o un líquido acuoso que tiene una presión osmótica de 310 mmol/l•H₂O (310 mOsm/kg•H₂O) o mayor;

(ii) un líquido acuoso, en el que dicho líquido acuoso (ii) es una disolución acuosa de un tensioactivo; y

(b) determinar inmunológicamente el contenido en medulasina humana en dicha muestra de sangre mediante un método que comprende poner en contacto la muestra de sangre que contiene dicha medulasina humana liberada de los leucocitos rotos en dicha etapa (a) con un anticuerpo monoclonal antimedulasina humana inmovilizado sobre un vehículo insoluble en presencia de un anticuerpo monoclonal antimedulasina humana marcado para formar un complejo de "sandwich", y capturar la medulasina humana sobre un complejo inmunológico marcado mediante una reacción de antígeno-anticuerpo, y después determinar la cantidad de actividad del material marcador en dicho complejo.

2. El método para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en sangre según la reivindicación 1, en el que dicho líquido acuoso (i) es un tampón y/o agua destilada que pueden incluir un disolvente orgánico soluble en agua.

3. El método para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en sangre según la reivindicación 1, en el que dicho líquido acuoso (i) es una disolución acuosa que contiene una sustancia soluble en agua seleccionada del grupo que consiste en sustancias formadas por sales de ácidos inorgánicos, sales de ácidos orgánicos, azúcares, alcoholes de azúcares, aminoácidos y proteínas.

4. El método para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en sangre según la reivindicación 1, en el que la cantidad de dicho líquido acuoso (i) utilizada es de 50 a 100000 veces la de la muestra de sangre en términos de unidades de volumen.

5. El método para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en sangre según la reivindicación 1, en el que dicho líquido acuoso (ii) es una disolución acuosa de al menos un tipo de tensioactivo seleccionado del grupo que consiste en sales de ácido graso superior, sulfonatos de alquilarilo, sulfonatos de alquilo, sales de éster de sulfato de alquilo, sales de alquilpiridinio, sales de alquiltrimetilamonio, polioxietilén alquilfenil éteres, polioxietilén alquil éteres, ésteres de ácido graso de polioxietilensorbitán, y alquilbetaínas.

6. El método para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en sangre según la reivindicación 1, en el que la cantidad de dicho líquido acuoso (ii) utilizada es de 50 a 100000 veces la de la muestra de sangre en términos de unidades de volumen.

7. Un método para diagnosticar la esclerosis múltiple, que se caracteriza porque incluye las siguientes etapas (a), (b) y (c):

(a) una etapa de romper los leucocitos en una muestra de sangre, poniendo en contacto dicha muestra de sangre con los siguientes líquidos acuosos (i) o (ii) o con una mezcla de los líquidos acuosos (i) y (ii):

(i) un líquido acuoso, que contiene 0,05% mol o más, o 0,005% mol o menos de un soluto, que tiene una presión osmótica de 250 mmol/l•H₂O (250 mOsm/kg•H₂O) o menor, o un líquido acuoso que tiene una presión osmótica de 310 mmol/l•H₂O (310 mOsm/kg•H₂O) o mayor;

(ii) un líquido acuoso, en el que dicho líquido acuoso (ii) es una disolución acuosa de un tensioactivo; y

(b) determinar inmunológicamente la cantidad de medulasina humana liberada hacia dicha muestra de sangre desde los leucocitos rotos en dicha etapa (a) utilizando un anticuerpo antimedulasina humana; y

(c) observar el tamaño y/o los cambios en el contenido en medulasina humana en la sangre obtenida en dicha etapa (b).

8. El método para diagnosticar la esclerosis múltiple según la reivindicación 7, en el que al menos uno de dichos anticuerpos antimedulasina humana es un anticuerpo monoclonal antimedulasina humana.

9. El método para diagnosticar la esclerosis múltiple según la reivindicación 7, en el que dicho líquido acuoso (i) es una disolución tampón y/o agua destilada que puede incluir un disolvente orgánico soluble en agua.

10. El método para diagnosticar la esclerosis múltiple según la reivindicación 7, en el que la cantidad de dicho líquido acuoso (i) utilizada es de 50 a 100000 veces la de la muestra de sangre en términos de unidades de volumen.

11. El método para diagnosticar la esclerosis múltiple según la reivindicación 7, en el que la cantidad de dicho líquido acuoso (ii) utilizada es de 50 a 100000 veces la de la muestra de sangre en términos de unidades de volumen.

12. El método para diagnosticar la esclerosis múltiple según la reivindicación 7, en el que dicha etapa (b) para determinar inmunológicamente el contenido en medulasina humana en dicha muestra de sangre comprende poner en contacto la muestra de sangre que contiene dicha medulasina humana liberada desde los leucocitos rotos en dicha etapa (a) con un anticuerpo antimedulasina humana inmovilizado sobre un vehículo insoluble en presencia de un anticuerpo antimedulasina humana marcado para formar un complejo de "sandwich" mediante una reacción de antígeno-anticuerpo, y después determinar la cantidad de marcador en dicho complejo.