INHIBIDORES Y/O ANTAGONISTAS DE LA PROTEINA HMGB1 DESTINADOS AL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES VASCULARES.

Utilización de un antagonista de la HMGB1 y de moléculas inhibidoras,

en la que la molécula se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo contra la HMGB1, o un fragmento de anticuerpo, o un ADN tetracatenario, o un fragmento de HMGB1 que compite con la HMGB1 por el enlace con el receptor e inhibe la activación del receptor, en la preparación de fármacos destinados al tratamiento de la reestenosis y/o de la ateroesclerosis

Inhibidores y/o antagonistas de la proteína HMGB1 destinados al tratamiento de enfermedades vasculares.

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y más particularmente a los inhibidores de la proteína HMGB1 y los antagonistas de la HMGB1 a utilizar en el tratamiento de enfermedades vasculares, entre ellas las debidas a la angioplastia.

La proteína HMGB1 (conocida, antes de 2001, como HMG; Bustin, 2001, Trends Biochem. Sci., 26, 152-153) es la proteína arquetípica de la familia con la secuencia de la HMG, que se caracteriza por la presencia de dominios de enlace con ADN, denominados cajas HMG. La HMG1 es una proteína pequeña de 25 kD, de 215 aminoácidos, con una secuencia muy conservada entre los mamíferos. La molécula de HMGB1 se organiza en tres dominios: dos dominios de enlace con ADN, HMG Secuencia A y Secuencia B, que vienen seguidos por una parte terminal ácida COOH compuesta de 30 residuos glutámico y aspártico. Las dos secuencias HMG, la secuencia A y la secuencia B, presentan 80 segmentos de aminoácidos (29% idénticos, 65% similares), con una estructura tridimensional en forma de L (Hardman et al., 1995, Biochemistry, 34: 16536-16607; Read et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21: 3427-3436; Weir et al., 1993, EMBO J., 12: 1311-1319).

La HMGB1 se identificó originalmente como una proteína nuclear abundante y ampliamente expresada. Se encuentra presente en más de 1 millón de copias por núcleo simple y se enlaza con el ADN bicatenario sin especificidad de secuencia. En cambio, la HMGB1 se enlaza con alta afinidad a estructuras específicas de ADN tal como ADN doblado o plegado y uniones cuádruples. Sin embargo, la HMGB1 se puede incorporar al ADN bicatenario mediante la interacción con distintas proteínas de enlace con el ADN. Cuando se enlaza con el ADN bicatenario, provoca la distorsión de la estructura, lo que permite la formación de complejos de nucleoproteínas en los que diversas proteínas de enlace con el ADN pueden entrar en contacto entre sí al mismo tiempo que se enlazan con sus respectivos sitos análogos de ADN (Müller et al., 2001, EMBO J., 16: 4337-4340 y otras referencias que se citan en la presente memoria). El fenotipo de ratones Hmgb1 -/- concuerda con este modo (Calogero et al., 1999, Nat. Genet., 22: 276-280).

Recientemente, ha pasado a ser el centro de atención un papel adicional que desempeña la HMGB1 en el exterior del núcleo celular: la HMGB1 actúa como mediador tardío en la letalidad provocada por endotoxinas así como en la inflamación pulmonar aguda en ratones; así como el nivel levado en suero de HMGB1 en pacientes septicémicos constituye un marcador del pronóstico (solicitud internacional de patente n.º WO 00/47104). La HMGB1 se puede secretar mediante macrófagos y pituicitos en cultivo como respuesta a las citocinas y a endotoxinas bacterianas (Abraham et al., 2000, J. Immunol., 165: 2950-2954; Wang et al., 1999, Surgery (St. Luis), 126: 389-392; Wang et al., 1999, Science, 285: 248-251). La liberación de HMGB1 de células de eritroleucemia murina se puede relacionar con la diferenciación celular y se puede encontrar la proteína en una forma asociada a la membrana plasmática en dichas células (Passalacqua et al., 1997, FEBS Lett., 400: 275-279; Sparatore et al: 1996, Biochem. J., 320: 253-256). Una proteína denominada amfoterina, con una secuencia idéntica a la HMGB1, se ha descrito en el encéfalo, donde se ha encontrado en el núcleo y el citoplasma de neuronas sí como en el espacio extracelular. Si se añade exógenamente, la HMGB1 interviene en el crecimiento de las consecuencias de los axones, y la migración de células de neuroblastoma y glioma que depende de la laminina se ve inhibida por anticuerpos contra la HMGB1 (Fages et al., 2000, J. Cell Sci., 113: 611-620; Merenmies et al., 1991, J. Biol. Chem., 266: 16722-16729; Parkkinen et al., 1993, J. Biol. Chem., 268: 19726-19738; Rauvala et al., 1988, J. Cell Biol., 107: 2293-2305). Las interacciones entre la HMGB1 y el sistema de activación del plasminógeno, en particular el t-PA (activador del plasminógeno de tipo tisular), tiene como resultado una aumento en la formación de plasmina (Parkkinen y Rauvala, 1991, J. Biol. Chem., 266: 16730-16735). La degradación de las proteínas de la matriz extracelular constituye una etapa importante en el proceso de migración celular y el aumento de la actividad de la proteasa extracelular estimulado por la HMGB1 puede permitir que las células migren.

Se ha identificado la HMGB1 como uno de los ligandos que se enlaza con el receptor RAGE (receptor para los productos finales de la glucación avanzada) (Hori et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 25752-25761). El RAGE es un receptor multiligando de la superfamilia de la inmunoglobulina y se expresa en diversos tipos celulares, entre ellos las células endoteliales, las fibras musculares lisas, los fagocitos mononucleares y las neuronas (Brett et al., 1993, Am. J. Phathol., 143: 1699-1712; Neeper et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 14998-15004). Interviene en diversos procesos patológicos, tales como la diabetes, amiloidosis y la ateroesclerosis (Schmidt et al., 1999, Circ. Res., 84: 489-497). La interacción entre la HMGB1 y el RAGE provoca el crecimiento de los axones, y las dos proteínas se encuentran juntas en la parte anterior de axones en progreso durante el desarrollo embrionario (Huttunen et al., 1999, J. Biol. Chem., 274: 19919-19924). Se observó el bloqueo del crecimiento tumoral y la metástasis al prevenir las interacciones entre la HMGB1 y el RAGE; además, la inhibición de dicha interacción evita la activación de las proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAP) y la expresión de metaloproteinasas matriciales, unas moléculas que se relacionan significativamente con la proliferación e invasión tumoral (Taguchi et al., 2000, Nature, 405: 354-360).

Además, se conoce actualmente que los inhibidores de la HMGB1 (es decir, la glicirrizina) se pueden utilizar como antinflamatorios (Sakamoto et al., 2001, Biol. Pharm. Bull., 24(8) 906-911; Yoh et al., Dig. Dis. Sci., 47(8) 1775-1781).

Los inventores de la presente invención han demostrado que la HMGB1 ejerce un potente efecto biológico en las fibras musculares lisas (SMC), uno de los tipos celulares en los que el RAGE se expresa en la superficie. Las SMC vasculares son las células predominantes en los vasos sanguíneos grandes; se encuentran en la túnica media donde se integran en la matriz extracelular. En los vasos intactos, las SMC se encuentran contraídas y presentan un fenotipo caracterizado por la ausencia de la división celular y la migración responsables del mantenimiento de la rigidez y la elasticidad de las paredes de los vasos y del control de la tensión arterial.

Cuando se daña el endotelio, tras lesiones mecánicas o inflamatorias, las SMC cambian a un fenotipo sintético y experimentan la división celular y la migración celular. La migración de las SMC de la túnica media a la túnica íntima, que tiene como resultado el aumento de espesor de la íntima, desempeña un papel importante en la fisiopatología de diversos trastornos vasculares, tales como la ateroesclerosis y la reestenosis tras una angioplastia coronaria. En el estado de síntesis, las SMC producen asimismo unas cantidades superiores de endopeptidasas extracelulares, factores de crecimiento y citocinas, y secretan una matriz extracelular fibrosa. Tras la lesión de la pared del vaso, la liberación de diversos factores de crecimiento y/o factores quimiotácticos tanto por parte de monocitos, macrófagos o trombocitos circulantes, como por parte de las células endoteliales lesionadas puede provocar que las SMC cambien del fenotipo contráctil al sintético y pueden dirigir la migración de las SMC hacia la íntima del vaso. Entre dichos factores, parece ser que uno de los más importantes es el bFGF pero, sin embargo, las SMC pueden iniciar asimismo la migración como respuesta a estímulos angiogénicos (Schwartz, 1997, J. Clin. Invest., 99: 2814-2816; Van Leeuwen, 1996, Fibrinolysis, 10: 59-74).

Al tratar de definir el efecto y el mecanismo mediante el que HMGB1 provoca la migración celular de las RSMC, los presentes inventores demostraron que la HMGB1 es un fuerte factor quimiotáctico y que provoca cambios en su forma celular y la reorganización del citoesqueleto. Dichos episodios se inhiben mediante la adición de un anticuerpo anti-RAGE...

1. Utilización de un antagonista de la HMGB1 y de moléculas inhibidoras, en la que la molécula se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo contra la HMGB1, o un fragmento de anticuerpo, o un ADN tetracatenario, o un fragmento de HMGB1 que compite con la HMGB1 por el enlace con el receptor e inhibe la activación del receptor, en la preparación de fármacos destinados al tratamiento de la reestenosis y/o de la ateroesclerosis.

2. Utilización de moléculas según la reivindicación 1, en la que la reestenosis comprende una reestenosis que se produce durante una angioplastia.

3. Utilización de moléculas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas moléculas se liberan mediante catéteres, instrumentos quirúrgicos o endoprótesis vasculares para la angioplastia.

4. Utilización de una molécula de HMGB1 en la preparación de fármacos que estimulan la regeneración del tejido conjuntivo.

5. Utilización de una molécula de HMGB1 en la preparación de fármacos que estimulan la cicatrización de una herida.

6. Utilización de un antagonista de la HMGB1 y de moléculas inhibidoras, en la que la molécula se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo contra la HMGB1, o un fragmento de anticuerpo, o un ADN tetracatenario, o un fragmento de HMGB1 en la preparación de fármacos que retardan o reducen o bloquean la regeneración del tejido conjuntivo.