INHIBIDORES DE PLASMINA DE LA SERPIENTE MARRON AUSTRALIANA, PSEUDONAJA TEXTILIS TEXTILIS.

Una preparación sustancialmente pura de un inhibidor de plasmina caracterizado porque este es un inhibidor competitivo de única etapa de plasmina y comprende la secuencia de aminoácido ECESTCAA,

en donde el inhibidor de plasmina tiene la fórmula general: **(Ver fórmula)** en donde: X es cualquier aminoácido; Y es un aminoácido hidrófobo; Ã es un aminoácido aromático o histidina; Z es K, R, H, D, E, Q o N; y B es un aminoácido neutro, o P, A, G, S, T, V o L, y en donde X en la posición 19 es R

Inhibidores de plasmina de la serpiente marrón australiana, Pseudonaja textilis textilis.

Campo de la invención

Está invención se relaciona con agentes antifibrinolíticos y en particular, inhibidores de plasmina novedosos que tienen predisposición reducida a producir trombosis de rebote. La presente invención también se relaciona con secuencias de aminoácido y secuencias de nucleótido que codifican los inhibidores de plasmina novedosos así como también con métodos para producir estos inhibidores y composiciones farmacéuticas que contienen los mismos.

Antecedente de la invención

La pérdida de sangre asociada con las principales formas de cirugía se ha compensado en el pasado por terapia de reemplazo, que puede involucrar plasma congelado fresco, sangre completa fresca y concentrados de plaquetas. Con los conocimientos recientes de una variedad de infecciones víricas de transmisión hemática (Hepatitis B y C, y virus de la inmunodeficiencia humana, VIH), es una prioridad principal la necesidad de reducir la pérdida de sangre durante la cirugía. Se ha generado ansiedad adicional dentro del Servicio Nacional de Transfusión de Sangre que se relaciona con la infectividad de los agentes relacionados con la Encefalitis Espongiforme Bovina (BSE) y Enfermedad de Creuzfeldt-Jacob (CJD) para las que actualmente no existen ensayos confiables.

Se ha establecido (Royston, 1990, Blood Coagul. Fibrinol. 1:53-69; Orchard et al, 1993, Br. J. Haemat. 85:596-599) que la actividad fibrinolítica desencadenada por vía de la ruta de plasminógeno-plasmina contribuye a hemorragia y que un inhibidor de plasmina tal como aprotinina ayuda a aliviar la pérdida de sangre. Esto parece sugerir que la digestión mediada por plasmina de coágulos de fibrina y componentes del sistema de coagulación puede ser de vital importancia como una contribución a este estado de hemorragia (Orchard et al, 1993, supra).

El uso de aprotinina durante la cirugía de bypas cardiopulmonar (CPB) es ahora de uso común (Royston, 1990, supra; Orchard et al, 1993, supra). En particular, Orchard et al (1993, supra) ha demostrado que la aprotina del inhibidor de fuente bovina, como la sustancia activa en el medicamento Trasylol^TM, reduce la pérdida de sangre en pacientes CPB mediante la neutralización de la actividad de plasmina y no afecta la actividad de las plaquetas. Este último hallazgo ha sido confirmado por otros investigadores (Ray and March, 1997, Thromb. Haemost. 78:1021-1026).

La aprotinina es un inhibidor de proteasa serina bien investigado, o "serpina". Este comprende 58 aminoácidos y actúa para inhibir la tripsina, •-quimiotripsina, plasminas así como también calicreína de plasma y tejido (Fritz and Wunderer, 1983, Drug Res. 33:479-494; Gebhard et al, 1986 In "Proteinasa Inhibitors", Barrett and Salvesen (eds.), Elsevier Science Publicaciones BV pp 374-387). También se ha encontrado que la aprotinina reacciona con trombina y los activadores de plasminógeno (tPA y uPA) (Willmott et al, 1995, Fibrinolysis 9:1-8).

Recientes estudios han mostrado que los homólogos generados semi-sintéticamente de aprotinina que contienen otros aminoácidos en lugar de lisina en la posición 15 de la secuencia de aminoácido tienen un perfil de acción y especificidad de acción que difiere distintivamente de aquellos de la aprotinina (Patente U.S. No 4,595,674; Wenzel et al, 1985, In "Chemistry of Peptides and Proteins" Vol. 3). Algunos de estos homólogos de aprotinina semisintéticos tienen, por ejemplo, una acción fuertemente inhibidora sobre la elastasa del páncreas y leucocitos. Otros homólogos de aprotinina con arginina en la posición 15, alanina en la posición 17, y serina en la posición 42, se caracterizan por un acción inhibidora que es distintamente mayor que aquella de la aprotinina en calicreína de plasma (cf. WO 89/10374).

También se puede utilizar la referencia a la Patente U.S. No 5,576,294 (Norris et al) que describe inhibidores de proteasa humana del mismo tipo como aprotinina. En particular, se describen variantes de inhibidor de proteasa tipo Kunitz humana que inhibe preferencialmente la elastasa neutrófila, catepsina G y/o proteinasa 3. Comparadas con la aprotinina, estas variantes tienen una carga negativa neta y se consideran que tienen un riesgo reducido de daño al riñón cuando se administran a pacientes en grandes dosis. En contraste, la aprotinina tiene un efecto nefrotóxico cuando se administra en dosis relativamente altas (Bayer, Trasylol, Inhibitor of proteinase; Glaser et al, In "Verhandlungen der Deutchen Gesellschaft Für Innere Medizin, 78. Kongress", Bergmann, München, 1972, pp 1612-1614). Se considera que esta nefrotoxicidad es una consecuencia de la carga fuertemente positiva neta de la aprotinina que origina la unión de las superficies cargadas negativamente de los túbulos del riñón.

Aunque no hay duda de que el uso clínico antifibrinolítico de aprotinina reduce la pérdida de sangre durante cirugía vascular, existe evidencia de la incidencia incrementada de la "trombosis de rebote" que se manifiesta en oclusión de injerto e infarto del miocardio perioperativo (Van der Meer et al, 1996, Thromb. Haemost. 75:1-3; Cosgrove et al, 1992, Annals Thorac. Surg. 54:1031-1038; Samama et al, 1994, Thromb. Haemost. 71:663-669). De acuerdo con estos hallazgos, se ha mostrado que la aprotinina tiene una especificidad un poco amplia y acción lenta cinética de unión ajustada sobre la plasmina (Willmott et al, 1995, supra). De acuerdo con lo anterior, la incidencia incrementada de trombosis de rebote puede ser una consecuencia de la unión ajustada de aprotinina a plasmina y neutralización concomitante irreversible del sistema fibrinolítico.

Hasta ahora, no existen agentes antifibrinolíticos efectivos descritos en la técnica anterior que reducen la predisposición a producir trombosis de rebote comparada con la aprotinina. Sin embargo, en un estudio reciente, Willmott et al (1995, supra) aislaron y caracterizaron un inhibidor de plasmina del veneno de la serpiente marrón Australiana, Pseudonaja textilis textilis con un perfil cinético prometedor con respecto a la trombosis de rebote. Esta preparación aislada de inhibidor de plasmina, denominada Textilinina (Txln), se encuentra que consiste de una única proteína de aproximadamente 7 kDa, como se evalúa con dodecil sulfato de sodio (SDS), electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) y teñido con azul Coomassie. En contraste con las muchas enzimas de proteasa serina inhibidas por aprotinina, la Txln no solo muestra inhibir la plasmina y la tripsina. También se muestra que conforma un mecanismo reversible competitivo de una etapa para la unión de la plasmina. En contraste, la aprotinina conforma un mecanismo reversible de dos etapas en donde la enzima y el inhibidor virgen reaccionan para producir inicialmente un complejo no covalente libre seguido por un complejo estable unido estrechamente, en el que la enzima y el inhibidor permanecen considerablemente sin cambio (Laskowski and Kato, 1980, Annu. Rev. Biochem. 49:593-626; Travis y Salvesen, 1983, Annu. Rev. Biochem. 52:655-709; Longstaff and Gaffney, 1991, Biochemistry 30:979-986). Más aún, se muestra que el Txln se une a la plasmina más rápidamente (constante de velocidad de disociación, k_i=3.85x10^-5 seg^-1 M^-1) y con K_i de menor afinidad (constante de disociación, K_i =1.4x10^-8M) que la aprotinina (constante de velocidad de disociación, k_-2= 1.64x10^-5 seg^-1 M^-1; constante de disociación, K_i = 5.3x10^-11 M - este último valor está en acuerdo cercano con un valor reportado previamente de K_i = 2x10^-10 M (Longstaff and Gaffney, 1992, Fibrinolysis 3:89-87)). Por lo tanto se sugiere que el perfil cinético de Txln puede ser clínicamente más atractivo con respecto a la trombosis de rebote que aquel de la aprotinina en el manejo de la hemorragia perioperativa y postoperativa.

Resumen de la invención

La presente invención resulta del descubrimiento inesperado de dos diferentes inhibidores de plasmina en el inhibidor de preparación de plasmina de Willmott et al (1995, supra) que se considera inicialmente que son sustancialmente homogéneos. De forma sorprendente, estos inhibidores de plasmina, denominados Textilinina 1 (Txln 1) y Textilinina 2 (Txln 2) comigran con una masa molecular de aproximadamente 7 kDa, cuando se evalúan mediante SDS-PAGE, y constituyen...

1. Una preparación sustancialmente pura de un inhibidor de plasmina caracterizado porque este es un inhibidor competitivo de única etapa de plasmina y comprende la secuencia de aminoácido ECESTCAA, en donde el inhibidor de plasmina tiene la fórmula general:

en donde:

X es cualquier aminoácido;

ddot{Y} es un aminoácido hidrófobo;

tilde{A} es un aminoácido aromático o histidina;

Z es K, R, H, D, E, Q o N; y

B es un aminoácido neutro, o P, A, G, S, T, V o L, y

en donde X en la posición 19 es R.

2. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la Z en la posición 3 es H o R.

3. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la Z en la posición 5 es K, N, E o D.

4. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la ddot{Y} en la posición 6 es F o L.

5. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la Z en la posición 8 es E o K.

6. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la B en la posición 10 es P o L.

7. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la B en la posición 11 es P o A.

8. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la Z en la posición 12 es E o D.

9. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la B en la posición 13 es T o I.

10. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la X en la posición 15 es P, S o R.

11. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la Z en la posición 17 es K, N, E, D o R.

12. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la X en la posición 18 es D, G, A o V.

13. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la X en la posición 20 es T, P, F o I.

14. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la B en la posición 21 es G, V o P.

15. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la X en la posición 22 es A, S o R.

16. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la tilde{A} en la posición 24 es Y o H.

17. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la X en la posición 26 es S o N.

18. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la B en la posición 27 es P, A o T.

19. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la Z en la posición 28 puede ser D o R.

20. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la Z en la posición 29 es E, D, H o Q.

21. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la Z en la posición 30 es H, K, R o Q.

22. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la Z en la posición 31 es K, Q o E.

23. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la B en la posición 33 es L o I.

24. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la Z en la posición 34 es E o K.

25. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la B en la posición 36 es L o I.

26. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la X en la posición 41 es E, G o K.

27. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la B en la posición 42 es C o G.

28. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la X en la posición 48 es K, N o I.

29. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, en donde la X en la posición 50 es K, Q o I.

30. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la secuencia de aminoácido NANNF.

31. El inhibidor de plasmina de las reivindicaciones 1 o 30, que comprende adicionalmente la secuencia de aminoácido YGGC.

32. El inhibidor de plasmina de las reivindicaciones 30 o 31 que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de:

(a) SEQ ID NO:2

(b) SEQ ID NO:4

(c) un fragmento biológicamente activo de una cualquiera de la SEQ ID NO:2 o 4, que comprende por lo menos 15 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2 o 4 y que retiene la inhibición competitiva de única etapa de plasmina; y

(d) un polipéptido que tiene por lo menos 90% de identidad para la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, o 4, y que retiene la inhibición competitiva de única etapa de plasmina.

33. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 32, en donde el polipéptido comprende por lo menos 15 aminoácidos contiguos que retienen la inhibición competitiva de única etapa de plasmina y un péptido líder que comprende la secuencia SEQ ID NO: 14, o un fragmento biológicamente activo del mismo.

34. El inhibidor de plasmina de la reivindicación 33, en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:18.

35. El inhibidor de plasmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 caracterizado adicionalmente porque este tiene una constante de disociación para plasmina en el rango de 1x10^-8 M^-1 a 1x10^-10 M^-1.

36. El inhibidor de plasmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 caracterizado adicionalmente porque este tiene una constante de disociación para plasmina en el rango de 5 x 10^-8 M^-1 a 8x10^-9 M^-1.

37. El inhibidor de plasmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 caracterizado adicionalmente porque este tiene una constante de disociación para plasmina en el rango de 1x10^-9 M^-1 a 5x10^-9 M^-1.

38. El inhibidor de plasmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 caracterizado adicionalmente porque este tiene una constante de velocidad de disociación para plasmina en el rango de 4x10^-5 seg^-1 M^-1 a 5x10^-7 seg^-1 M^-1.

39. El inhibidor de plasmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 caracterizado adicionalmente porque este tiene una constante de velocidad de disociación para plasmina en el rango de 1x10^-6 seg^-1 M^-1 a 1x10^-7 seg^-1 M^-1.

40. El inhibidor de plasmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 caracterizado adicionalmente porque este tiene una constante de velocidad de disociación para plasmina en el rango de 2x10^-6 seg^-1 M^-1 a 9x10^-6 seg^-1 M^-1.

41. El inhibidor de plasmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 en donde por lo menos 60% del material total en la preparación es el inhibidor de plasmina.

42. El inhibidor de plasmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 en donde por lo menos 75% del material total en la preparación es el inhibidor de plasmina.

43. El inhibidor de plasmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 en donde por lo menos 90% del material total en la preparación es el inhibidor de plasmina.

44. El inhibidor de plasmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 en donde por lo menos 95% del material total en la preparación es el inhibidor de plasmina.

45. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34.

46. El polinucleótido aislado de la reivindicación 45 seleccionado del grupo que consiste de:

(a) SEQ ID NO:1;

(b) SEQ ID NO:3; y

(c) un polinucléotido que hibrida bajo condiciones exigentes a cualquiera de las secuencias de polinucleótido anteriores y que codifica un polipéptido que retiene la inhibición competitiva de única etapa de plasmina.

47. El polinucleótido de la reivindicación 46 que comprende adicionalmente una secuencia de nucleótido que codifica un péptido líder.

48. El polinucleótido de la reivindicación 47, en donde la secuencia de nucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO:13 o un polinucléotido que hibrida bajo condiciones exigentes a la secuencia anterior y que codifica un polipéptido que retiene la inhibición competitiva de única etapa de plasmina.

49. El polinucleótido de la reivindicación 47, en donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:43.

50. Una composición farmacéutica para aliviar la pérdida de sangre en un paciente, dicha composición comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 y un portador farmacéuticamente aceptable.

51. Uso del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, formulado opcionalmente con un portador farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento para aliviar la pérdida de sangre.

52. Un agente antineoplásico que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 conjugado con un anticuerpo antifibrina.