Procedimiento in vitro de determinación de la fase y/o diagnóstico de un estado preneoplásico y/o neoplásico en un sujeto mamífero,

preferiblemente en un ser humano, que comprende:

detectar un perfil de expresión de uno o más receptores P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2X6 y P2X7 de células y/o tejidos de dicho sujeto, donde el perfil de expresión del receptor se detecta mediante un reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X y

comparar el perfil con un perfil de expresión predeterminado de células y/o tejidos normales

Procedimiento de identificación de estados preneoplásicos y/o neoplásicos en mamíferos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a procedimientos de identificación de estados preneoplásicos y/o neoplásicos en mamíferos y, en particular, a un procedimiento para identificar células preneoplásicas y neoplásicas en tejidos y fluidos corporales, basándose en la expresión diferencial de receptores purinérgicos en estas células.

Antecedentes

Cuando se diagnostica el cáncer, se tienen en cuenta características celulares en las muestras de biopsia tales como el grado de variabilidad del tamaño y la forma de las células cancerosas, la proporción de células en división activa y la invasión de estructuras vecinas. Son tinciones histológicas usadas comúnmente la hematoxilina (tinción primaria) y la eosina (contratinción) que marcan de forma diferencial los elementos subcelulares. Otros procedimientos de diagnóstico emplean anticuerpos contra moléculas de diagnóstico particulares dentro de (por medio de epítopos intracelulares) o en la superficie de células o tejidos (por medio de epítopos extracelulares) que pueden hacerse visibles para su análisis microscópico, por ejemplo, antígeno carcinoembrionario (CEA). Algunos ejemplos específicos se analizan a continuación.

Cáncer de próstata

La incidencia de cáncer de próstata en el mundo occidental está aumentando a una velocidad alarmante, habiéndose más que duplicado en los últimos cinco años. Tiene mayor incidencia que cualquier neoplasia, siendo sólo segunda al cáncer pulmonar como la causa más común de muerte por cáncer en hombres en todo el mundo, y es la causa principal de muerte en Australia [1]. La hiperplasia prostática benigna (BPH) es común en hombres mayores de 50 años y es un precursor posible de la neoplasia intraepitelial prostática (PIN), de por sí una precursora del cáncer de próstata. Los estudios postmortem indican que el 70% de los hombres tienen células malignas en su próstata cuando llegan a los 80 años [2]. Esta enfermedad se caracteriza por una variación racial sorprendente y es más prevalente en afroamericanos, intermedia en caucásicos, ligeramente menor en latinos y menos prevalente en asiáticos. No obstante, en este último grupo es la forma de neoplasia que está aumentando más rápidamente. Hasta recientemente, no estaba claro si estas diferencias se debían a la variación genética racial o a la dieta. Los estudios han demostrado ahora que la dieta es un factor de influencia principal [3].

Diagnóstico y tratamiento actual del cáncer de próstata

A pesar de la gravedad de esta afección, los procedimientos de diagnóstico son escasos e imprecisos. Los procedimientos actuales para evaluar el pronóstico tales como el examen rectal digital (DRE), ultrasonidos, niveles de fosfatasa ácida prostática, supresión androgénica, densidad del antígeno prostático específico (PSA), velocidad del PSA, intervalos de referencia específicos por edad del PSA y clasificación histopatológica de Gleason, pueden no proporcionar una información predictiva fiable respecto al desenlace clínico del cáncer de próstata [4]. Por ejemplo, los estudios han demostrado que el DRE da como resultado una tasa de falsos negativos del 36,9% [5]. El PSA es una serina proteasa de 33 kDa que está asociada con varios tejidos aparte de la próstata [6], está regulada positivamente por andrógenos, glucocorticoides y progestágenos y se piensa que está implicada en la regulación de factores de crecimiento. Desgraciadamente, los niveles séricos de PSA tienen una incidencia de diagnósticos falsos negativos del 23% y de diagnósticos falsos positivos del 36,7% [6]. Incluso se ha sugerido que más de la mitad de los nuevos casos detectados por exploración son de hecho falsos positivos [7]. Los intentos por mejorar los procedimientos de exploración mediante la introducción de ensayos adicionales tales como densidad, velocidad e intervalos de referencia específicos por edad del PSA han sido equívocos. Un estudio ha demostrado que la aplicación de un intervalo de referencia del PSA específico por edad que aumenta el límite superior del PSA normal hasta 4,5 ng/ml da como resultado la falta de detección de un número sustancial de cánceres clínicamente significativos [8]. Dada esta incertidumbre, con frecuencia se realiza una biopsia de próstata para confirmar el tumor maligno, pero este ensayo también tiene una incidencia de diagnósticos falsos negativos altamente insatisfactoria del 23% [9].

La elección de tratamiento depende en gran medida de la determinación de la fase clínica basándose en el análisis microscópico de secciones de tejido [10]. Esta técnica depende del juicio y de una experiencia considerable en relacionar el aspecto histológico con el desenlace clínico. Desgraciadamente, es bien sabido que el tejido del cáncer de próstata es muy heterogéneo y puede pasarse por alto fácilmente una característica de diagnóstico vital en la sección que se está examinando. Para complicar más la situación, no se han realizado ensayos aleatorizados y controlados para examinar los resultados de la cirugía y la radioterapia [2]. Las elecciones de tratamiento incluyen prostatectomía radical, terapia de radiación, supresión androgénica y "vigilancia activa". Una respuesta definitiva a la cuestión de la "vigilancia activa" frente a la intervención radical espera a la finalización del ensayo de intervención frente a observación en el cáncer de próstata [11]. Las consecuencias de estas decisiones para el paciente son importantes. Por ejemplo, la prostatectomía radical da como resultado a menudo incontinencia, impotencia, constricción del cuello de la vejiga y depresión [12]. Claramente, se necesitan con urgencia marcadores mejorados que diferencien de forma fiable entre hiperplasia prostática benigna (BPH), neoplasia intraepitelial prostática (PIN), hiperplasia adenomatosa atípica (AAH) y cáncer de próstata.

El papel de receptores P2X en el cáncer

Los neurotransmisores tales como la noradrenalina y acetilcolina actúan, no sólo en la sinapsis y la unión neuromuscular, sino también sobre receptores celulares específicos de transmisores en una amplia diversidad de tejidos y órganos. Estos receptores son canales transmembrana tipo poro que introducen iones en la célula. El trifosfato de adenosina (ATP), más conocido como la moneda molecular de los depósitos de energía intracelulares, se propuso por primera vez como neurotransmisor periférico basándose en su capacidad para contraer el músculo liso [13]. El ATP actúa de la misma forma que otros neurotransmisores y puede activar tanto los receptores tisulares acoplados a proteína G (relativamente lentos) (P2Y) como los canales iónicos purinérgicos dependientes de ligando (rápidos) (P2X1-7) caracterizados más recientemente, y también puede actuar como cotransmisor. A pesar de su descubrimiento relativamente reciente, es probable que el sistema transmisor purinérgico se desarrollase muy pronto en la evolución [14].

Actualmente existen 7 subtipos de receptor P2X genéticamente diferentes. Están tan ampliamente distribuidos como los receptores de los sistemas colinérgico y adrenérgico y se encuentran en la mayoría de las células de mamífero [14]. Estos receptores constituyen una nueva clase de canales de respuesta rápida, unidos a membrana, dependientes de ligando, permeables al calcio, selectivos de cationes que se activan por el ATP extracelular de las terminaciones nerviosas o una fuente tisular local [15-18]. Son predominantemente permeables a iones de calcio pero también admiten otros cationes, tales como potasio y sodio, mediando de este modo la despolarización [19]. Por ejemplo, en el epitelio pulmonar, los canales P2X estimulan la regulación positiva del canal de Cl^-, la secreción de K⁺ e inhiben la absorción de Na⁺ (21). El ATP puede estimular tanto la síntesis de ADN como la proliferación celular por medio de la regulación positiva de los receptores P2X [14]. Esta función está ligada a la estimulación de la fosfolipasa C y a la liberación de calcio iónico de depósitos intracelulares sensibles a fosfato de inositol, así como a otras rutas de transducción de señales. Estas acciones se potencian por la acción sinérgica del ATP con factores de crecimiento polipeptídicos [20]. El flujo de entrada de calcio a través de los receptores P2X también desencadena la secreción de otros neurotransmisores, sirve como señal para la activación de canales de potasio dependientes de calcio, inactiva otros tipos de canales de calcio, regula la recuperación endocítica de membranas de...

1. Procedimiento in vitro de determinación de la fase y/o diagnóstico de un estado preneoplásico y/o neoplásico en un sujeto mamífero, preferiblemente en un ser humano, que comprende:

detectar un perfil de expresión de uno o más receptores P2X₁, P2X₂, P2X₃, P2X₄, P2X₅, P2X₆ y P2X₇ de células y/o tejidos de dicho sujeto, donde el perfil de expresión del receptor se detecta mediante un reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X y

comparar el perfil con un perfil de expresión predeterminado de células y/o tejidos normales.

2. Procedimiento in vitro para determinar la etiología de la carcinogénesis en un sujeto mamífero, preferiblemente en un ser humano, que comprende:

detectar un perfil de expresión de uno o más receptores P2X₁, P2X₂, P2X₃, P2X₄, P2X₅, P2X₆ y P2X₇ de células y/o tejidos de dicho sujeto, donde el perfil de expresión del receptor se detecta mediante un reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X y

comparar el perfil con perfil de expresión predeterminado de células y/o tejidos normales.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que las células son células de próstata.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que las células son células de mama.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el estado preneoplásico y/o neoplásico es una afección de la próstata.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el estado preneoplásico y/o neoplásico es una afección de la mama.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X está en forma de antisuero policlonal.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X está en forma de antisuero monoclonal.

9. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X es específico para P2X₁, P2X₂, P2X₃, P2X₄, P2X₅, P2X₆ o P2X₇.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X es específico para P2X₁, P2X₂, P2X₃ o P2X₇.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X es una serie de anticuerpos policlonales.

12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X es una serie de anticuerpos monoclonales.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 o con la reivindicación 12, en el que la serie de anticuerpos de receptor P2X comprende una combinación de anticuerpos específicos para P2X₁, P2X₂, P2X₃ y P2X₇.

14. Procedimiento in vitro de determinación de la fase y/o diagnóstico de un estado preneoplásico y/o neoplásico en un sujeto mamífero, preferiblemente en un ser humano, que comprende el uso de una célula o muestra de tejido de mamífero aislada de dicho sujeto formando un complejo con un reactivo de anticuerpo específico de receptor purinérgico P2X específico para P2X₁, P2X₂, P2X₃, P2X₄, P2X₅, P2X₆ o P2X₇ para detectar un perfil de expresión del receptor purinérgico P2X de células y/o tejido de dicho sujeto y la comparación del perfil con un perfil de expresión predeterminado de células y/o tejidos normales.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el reactivo de anticuerpo específico de receptor purinérgico P2X comprende un antisuero policlonal.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X comprende un antisuero monoclonal.

17. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que el reactivo de anticuerpo específico de receptor purinérgico P2X es específico para P2X₁, P2X₂, P2X₃ o P2X₇.

18. Kit para diagnosticar un estado preneoplásico y/o neoplásico en un mamífero que comprende medios para la detección del perfil de expresión del receptor purinérgico P2X en una muestra que comprende células y/o tejido del mamífero y medios para la comparación del nivel de expresión con un nivel de expresión predeterminado, en el que el medio de detección comprende un reactivo de anticuerpo específico para dos o más receptores purinérgicos P2X seleccionados del grupo que consiste en P2X₁, P2X₂, P2X₃, P2X₄, P2X₅, P2X₆ y P2X₇.

19. Kit de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X comprende un antisuero policlonal.

20. Kit de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X comprende un antisuero monoclonal.

21. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en el que el reactivo de anticuerpo es específico para P2X₁, P2X₂, P2X₃ o P2X₇.

22. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que el perfil de expresión del receptor purinérgico P2X se detecta mediante un ensayo colorimétrico.

23. Kit de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el ensayo es un ELISA.

24. Kit de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el ensayo es un RIA.

25. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que la muestra es un fluido corporal.

26. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que la muestra es un exudado de examen rectal digital.

27. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que la muestra es una muestra de biopsia.

28. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-17, en el que el reactivo de anticuerpo específico para un receptor purinérgico P2X, en el que el reactivo es capaz de diferenciar entre células y/o tejido preneoplásicos o neoplásicos y células y/o tejido normales.

29. Procedimiento in vitro de diagnóstico del cáncer de próstata en un sujeto que comprende detectar un receptor purinérgico P2X₇ en células y/o tejido de próstata del sujeto usando un anticuerpo contra P2X₇.