GLUTAMINA:FRUCTOSA-6-FOSFATO AMIDOTRANSFERASA (GFAT) QUE COMPRENDE UNA ETIQUETA DE PURIFICACION INTERNA, Y SU UTILIZACION PARA EL CRIBADO DE COMPUESTOS.
Proteína que posee una actividad GFAT que comprende:
una secuencia de GFAT y por lo menos una secuencia de una etiqueta de purificación,
siendo la secuencia de la etiqueta de purificación insertada entre dos aminoácidos consecutivos de la secuencia de GFAT, estando dichos aminoácidos comprendidos en:
una secuencia de GFAT que corresponde a la secuencia que se extiende entre los aminoácidos 30 a 80 de la GFAT de Escherichia coli, o
una secuencia de GFAT que corresponde a la secuencia que se extiende entre los aminoácidos 220 a 230 de la GFAT de Escherichia coli
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2004/001800.
Solicitante: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS).
Nacionalidad solicitante: Francia.
Dirección: 3, RUE MICHEL-ANGE,75794 PARIS CEDEX 16.
Inventor/es: BADET-DENISOT,MARIE-ANGE,JULIETTE,ETIENNETTE, BADET,BERNARD,FRANCOIS.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 17 de Marzo de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/10F
- C12Q1/48 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una transferasa.
Clasificación PCT:
- C07K1/14 C […] › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › Extracción; Separación; Purificación.
- C12N15/54 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Transferasas (2).
- C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
- C12N9/90 C12N 9/00 […] › Isomerasas (5.).
- C12Q1/48 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una transferasa.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) que comprende una etiqueta de purificación interna, y su utilización para el cribado de compuestos.
La presente invención se refiere a una glutamina:fructosa-6-fosfato aminotransferasa modificada, purificable rápidamente y en cantidades suficientes para el cribado de compuestos que modifican su actividad.
Las glutamina:fructosa-6-fosfato aminotransferasas (GFAT), EC 2.6.1.16, denominadas asimismo glucosamina-6-fosfato sintasas o 2-desoxi-glucosa-6-fosfato cetol isomerasas, están implicadas en la vía de biosíntesis de las hexosaminas. La GFAT cataliza la primera etapa, limitante, de esta vía de biosíntesis según la reacción:
Una forma bacteriana recombinante de la GFAT, la glucosamina-6-fosfato sintasa de Escherichia coli, ha sido purificada hasta homogeneidad y estudiada de manera exhaustiva. Las propiedades y el mecanismo enzimático de la transferencia de la amida han sido en particular ampliamente descritas (para revisión Teplyakov et al., Nat. Prod. Rep. (2002) 19:60). En particular, esta enzima, cuya estructura cristalina ha sido resuelta (Teplyakov et al., J. Mol. Biol. (2001) 313:1093), está formada por dos dominios, uno que tiene una actividad hidrolasa (glutaminasa) y el otro una actividad isomerasa.
Por otro lado, se han secuenciado unas GFAT de eucariotas, incluyendo en particular la de hígado de rata (Huynh et al., Arch. Biochem. Biophys. (2000) 379:307) y la de la levadura Candida albicans (Milewsky et al., J. Biol. Chem. (1999) 274:4000).
En el ser humano, unos estudios preliminares han mostrado la presencia de una actividad GFAT en el hígado (Ghosh et al., J. Biol. Chem. (1960) 235:1265). A partir de entonces se conocen varias GFAT. GFAT1, la forma principal, GFAT2, que se expresa preferentemente en el sistema nervioso central, y GFAT1Alt, una isoforma de GFAT1, expresada esencialmente en los músculos estriados. Las secuencias peptídicas de GFAT1 y GFAT2 poseen 75% de identidad de secuencias entre sí, y las de GFAT1 y GFAT1Alt son idénticas salvo para una inserción de 18 aminoácidos en la secuencia de GFAT1Alt. Las secuencias de GFAT están por lo tanto muy conservadas en el ser humano, pero igualmente entre las especies, puesto que las secuencias peptídicas de la GFAT1 humana y de la GFAT de E. coli o de la GFAT1 de ratón presentan respectivamente 35% y 99% de identidad.
El gen de la GFAT1 humana ha sido clonado en 1992 (McKnight et al., J. Biol. Chem. (1992) 267:25208). Codifica una proteína de 77 kDa formada por dos dominios distintos (Teplyakov et al., Nat. Prod. Rep. (2002) 19:60).
El aumento de la producción de UDP-NAc-GIcNH2, el producto final de la vía de biosíntesis de las hexosaminas, y su acumulación en los tejidos han estado recientemente implicados en el desarrollo de la resistencia a la insulina (Marshall et al., FASEB J. (1991) 5:3031, Yki-Jarvinen et al., Diabetes (1996) 45:302, Thompson et al., J. Biol. Chem. (1997) 272: 7759, Hawkins et al., J. Clin. Invest. (1997) 99:2173, Robinson et al., Diabetes (1993) 42:1333, Daniels et al., J. Clin. Invest. (1995) 96:1235, Baron et al., J. Clin. Invest. (1995) 96:2792).
Así, se ha mostrado que un aumento del nivel celular de UDP-NAc-GIcNH2 mediante una modesta sobreexpresión de GFAT1, o una aportación de glucosamina exógena, puede inducir una resistencia a la insulina al mismo tiempo in vivo y en unos adipocitos en cultivo (Robinson et al., Diabetes (1993) 42:1333, Daniels et al., J. Clin. Invest. (1995) 96:1235, Baron et al., J. Clin. Invest. (1995) 96:2792, Hebert et al., J. Clin. Invest. (1996) 98:930).
En efecto, la insulina activa su vía de transducción fijándose a su receptor, lo que induce la translocación de los vehículos de glucosa, tales como el receptor GLUT4, almacenados en la célula, hacia la membrana, y aumenta el aflujo de glucosa. La glucosa entra así en la vía de la glicolisis y se convierte en glucosa-6-fosfato y después en fructosa-6-fosfato. Cuando el aflujo de glucosa es excesivo, el fructosa-6-fosfato entra en la vía de biosíntesis de las hexosaminas y se convierte en glucosamina-6-fosfato por la GFAT. Varias observaciones indican que los metabolitos del glucosamina-6-fosfato impiden la translocación de los receptores a la glucosa hacia la membrana celular, disminuyendo así el aflujo de la glucosa celular (Marshall et al., FASEB J. (1991) 5:3031, Giacarri et al., Diabetologia (1995) 38:518, Marshall et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:4706, Paterson et al., Endocrinology (1995) 136:2809).
El mecanismo mediante el cual los metabolitos del glucosamina-6-fosfato ejercen sus efectos fisiológicos no está claro. Se ha propuesto sin embargo una hipótesis: una concentración citosólica elevada de UDP-NAc-GIcNH2 provocaría la hiperglicosilación de los sitios de fosforilación Ser o Thr, conduciendo de esta manera a la detención de la vía de señalización de la insulina (Comer et al., J Biol. Chem (2000) 275:29179).
La actividad GFAT se considera por lo tanto como una de las causas de los altos niveles de glucosa en sangre; por otro lado, se conoce por ser elevada en los pacientes que padecen diabetes azucarada no-insulino-dependiente o diabetes de tipo II (Yki-Jarvinen et al., Diabetes (1996) 45:302).
La obtención de inhibidores de la GFAT permitiría reducir la glicemia en particular en los individuos que padecen patologías relacionadas con una hiperglicemia, tales como la diabetes de tipo II, la acidosis y/o la cetosis diabética, por ejemplo.
Unos inhibidores de la GFAT de planta o de hongo podrían asimismo permitir obtener respectivamente unos fungicidas y unos herbicidas.
Sin embargo, a pesar de la obtención de formas recombinantes de GFAT, la inestabilidad de las preparaciones enzimáticas obtenidas, su baja cantidad, y su nivel de purificación insuficiente, no han permitido obtener unos inhibidores eficaces de GFAT.
Un objetivo de la invención es por lo tanto proporcionar una GFAT modificada cuya actividad es estable y que se puede obtener en gran cantidad, con un alto nivel de pureza y de actividad.
La presente invención se refiere a una proteína enzimáticamente activa que comprende:
Se designa por el término GFAT una enzima de la clase E.C. 2.6.1.16 que cataliza la reacción siguiente:
GFAT se designa con el nombre de glutamina:fructosa-6-fosfato aminotransferasa, o también glucosamina-6-fosfato sintasa o 2-desoxi-glucosa-6-fosfato cetol...
Reivindicaciones:
1. Proteína que posee una actividad GFAT que comprende:
una secuencia de GFAT y por lo menos una secuencia de una etiqueta de purificación, siendo la secuencia de la etiqueta de purificación insertada entre dos aminoácidos consecutivos de la secuencia de GFAT, estando dichos aminoácidos comprendidos en:
2. Proteína según la reivindicación 1, en la que la secuencia de GFAT corresponde a una secuencia de GFAT de bacteria o de eucariota, en particular de planta, de hongo o de animal, en particular de insecto o de mamífero, más particularmente del ser humano.
3. Proteína según la reivindicación 1 ó 2, en la que la secuencia de la etiqueta de purificación se inserta entre dos aminoácidos consecutivos de la secuencia de una GFAT humana, estando dichos aminoácidos comprendidos entre los aminoácidos 40 a 50 y/o 290 a 330 de dicha secuencia de GFAT humana.
4. Proteína según una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la secuencia de GFAT corresponde a:
5. Proteína según una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la secuencia de la etiqueta de purificación se inserta entre dos aminoácidos consecutivos, estando dichos aminoácidos comprendidos entre los aminoácidos:
6. Proteína según la reivindicación 5, en la que la secuencia de la etiqueta de purificación se inserta entre los aminoácidos:
7. Proteína según una de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la etiqueta de purificación corresponde a una secuencia de 2 a 10 aminoácidos, en particular de 4 a 8 aminoácidos.
8. Proteína según una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la etiqueta de purificación es una hexa-histidina.
9. Proteína según las reivindicaciones 6 y 8, que corresponde a las secuencias:
10. Ácido nucleico que comprende o que está constituido por una secuencia que codifica para una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Ácido nucleico que comprende o que está constituido por la secuencia nucleotídica:
12. Vector eucariota o procariota que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 10 u 11.
13. Procedimiento de purificación de una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 9, a partir de una disolución que comprende dicha proteína, que comprende una etapa de puesta en presencia de dicha disolución con un compuesto que se une específicamente a la etiqueta de purificación de dicha proteína, y una etapa de separación del complejo formado por la unión de dicha proteína a dicho compuesto de los demás constituyentes de la disolución.
14. Procedimiento de purificación según la reivindicación 13, que comprende una etapa de puesta en presencia de una disolución que comprende una proteína según la reivindicación 9, con un compuesto que comprende un catión metálico divalente seleccionado de entre el Ni2+ o el Co2+, en particular el Ni2+, y una etapa de separación del complejo formado por la unión de la proteína a dicho compuesto de los demás constituyentes de la disolución.
15. Procedimiento de conservación de una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 9 en forma enzimáticamente activa, en particular a -80ºC o a 4ºC, que comprende la adición de dicha proteína a una disolución que comprende:
16. Composición que comprende una proteína GFAT activa unida a una etiqueta de purificación según una de las reivindicaciones 1 a 9, siendo dicha proteína susceptible de poder ser conservada en una forma enzimáticamente activa, durante por lo menos 8 días a una temperatura de 2ºC a 10ºC, en particular 4ºC, y durante por lo menos 12 meses a una temperatura de -100ºC a -20ºC, en particular -80ºC, estando dicha proteína en asociación con:
17. Utilización de una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 9, para el cribado de compuestos que modifican la actividad de dicha proteína, en particular para el cribado de un inhibidor de dicha proteína.
18. Utilización según la reivindicación 17, para el cribado de compuestos útiles en el marco del tratamiento o de la prevención de la diabetes, en particular de la diabetes de tipo II, de la obesidad, de la acidosis, de la cetosis, de la artritis, de los cánceres, o de la osteoporosis.
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