Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII,

en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de ácido siálico; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico

Glicoformas de Factor VII.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones comprendiendo Factor VII y otros factores de coagulación sanguínea que tienen modelos alterados de glicosilación ligados a la asparagina.

Antecedentes de la invención

Las proteínas implicadas en la cascada de la coagulación, incluyendo, p. ej., factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, y proteína C, están demostrando ser agentes terapéuticos útiles para tratar una variedad de condiciones patológicas. Por consiguiente, hay una necesidad en aumento de formulaciones que comprenden estas proteínas que son farmacéuticamente aceptables y exhiben una uniforme y predeterminada eficacia clínica.

Debido a las muchas desventajas de utilizar el plasma humano como una fuente de productos farmacéuticos, se prefiere producir estas proteínas en sistemas recombinantes. Las proteínas de coagulación, no obstante, se someten a una variedad de modificaciones co- y postranscipcionales, incluyendo, p. ej., glicosilación ligada a la asparagina (ligada a N); glicosilación ligada a O; y ?-carboxilación de los residuos glu. Estas modificaciones pueden ser diferentes de forma cualitativa o cuantitativa cuando se utilizan células heterólogas como huéspedes para la producción a gran escala de las proteínas. En particular, la producción en células heterólogas resulta a menudo en una selección de diferentes glicoformas, que son polipéptidos idénticos que tienen diferentes estructuras de oligosacáridos ligadas de manera covalente.

En diferentes sistemas, las variaciones en la estructura de oligosacáridos de las proteínas terapéuticas se han ligado a, entre otras cosas, cambios en la inmunogenicidad y en el aclaramiento in vivo. Así, hay una necesidad en la técnica de composiciones y métodos que proporcionen preparaciones de proteínas de coagulación, particularmente preparaciones que comprenden factor VII recombinante humano, factor VII modificado, o polipéptidos relacionados con el Factor VII, que contienen modelos predeterminados de glicoformas.

Kemball-Cook et al. (Gene 1994, 139(2): 275-279) describe experimentos en los que los cultivos a pequeña escala de factor VII que expresan células CHO-K1 se incubaron en medios carentes de suero.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a preparaciones que comprenden polipéptidos del Factor VII que exhiben modelos predeterminados de las glicoformas. Como se utiliza en este caso, una preparación de factor VII se refiere a una pluralidad de polipéptidos del factor VII, incluyendo variantes y formas químicamente modificadas, al igual que formas que se han activado proteolíticamente (p. ej..factor VIIa), que se han separado de la célula en la que se sintetizaron. Un modelo de glicoformas se refiere a la distribución en la preparación de cadenas de oligosacáridos que tienen estructuras variables que están ligadas de forma covalente a los polipéptidos del factor VII.

En un aspecto, la invención proporciona una preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde uno o más de los siguientes (i)-(iv) se aplica: (i) entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de ácido siálico; (II) entre aproximadamente un 1-7% de las cadenas de oligosacáridos tienen una carga neutra; (iii) entre aproximadamente un 6-16% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo de galactosa terminal; y (iv) entre aproximadamente un 11-23% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una galactosa terminal o residuo de N-acetilgalactosamina; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico. En algunas formas de realización, además de uno o más de (i)-(iv): todos los residuos de ácido siálico en las cadenas de oligosacáridos están ligadas a la galactosa mediante un enlace a2->3; al menos algunos de los residuos de ácido siálico comprenden ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) además de ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac); y/o las cadenas de oligosacáridos comprenden residuos de fucosa ligados a1->6 a una N-acetilglucosamina de núcleo. En una forma de realización, la invención abarca una preparación que comprende un factor VIIa de tipo salvaje en la que entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos tienen al menos un residuo de ácido siálico y todos los residuos del ácido siálico están ligados a la galactosa mediante un enlace a2->3. En otra forma de realización, la invención abarca una preparación que comprende un factor VIIa de tipo salvaje en el que entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos tiene al menos un residuo de ácido siálico y al menos algunos de los residuos de ácido siálico son ácido N-glicolilneuramínico. Las preparaciones de la presente invención no abarcan así el factor VII de tipo salvaje o factor VIIa que se ha aislado del plasma humano y que no se ha modificado ex vivo por tratamiento de glicosidasa.

En otro aspecto, la invención proporciona una preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde al menos aproximadamente un 2% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una fucosa ligada en a1->3a un residuo antenario de N-acetilglucosamina (es decir, un residuo de N-acetilglucosamina que está ligado en ß1->2,4 o 6 a un residuo Man) y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico. Preferiblemente, al menos aproximadamente un 5% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un tal residuo antenario de fucosa; más preferiblemente, al menos aproximadamente un 10% o 20%; y de la forma más preferible, al menos aproximadamente un 40%.

Las preparaciones según la invención pueden comprender uno o más de factor VII de tipo salvaje sin modificar; el factor VII de tipo salvaje que se han sometido a modificación química y/o enzimática; y variantes del factor VII que tienen una o más alteraciones en la secuencia de aminoácidos en relación al factor VII de tipo salvaje. Las preparaciones de la invención se pueden derivar de células humanas con expresión del factor VII de un gen endógeno de factor VII o de células programadas para expresar polipéptidos del factor VII de un gen recombinante.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para producir una preparación que comprende polipéptidos del factor VII con un modelo predeterminado de glicosilación ligada a N, los métodos que comprenden cultivar una célula que expresa los polipéptidos bajo condiciones en las que al menos aproximadamente un 94% de los oligosacáridos ligados a asparagina ligados a los polipéptidos del factor VII comprenden al menos un residuo de ácido siálico, p. ej., uno, dos, tres, o cuatro residuos de ácido siálico. En algunas formas de realización, los métodos se llevan a cabo cultivando una célula que expresa los polipéptidos bajo condiciones en las que al menos aproximadamente un 5% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una fucosa ligada en a1->3 a un residuo antenario de N-acetilglucosamina. En algunas formas de realización, los polipéptidos del factor VII, con independencia de su fuente, se someten a tratamientos enzimáticos para conseguir los modelos de las glicoformas deseadas.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden las preparaciones de la invención y el uso de los mismos para la preparación de un medicamento para tratar los trastornos de la coagulación. Los métodos comprenden administrar las formulaciones farmacéuticas a un paciente en necesidad de tratamiento, bajo condiciones que resultan en bien un aumento o inhibición en la coagulación sanguínea. En una serie de formas de realización, las preparaciones de factor VII se administran cuando se desea aumentar la coagulación sanguínea, tal como, p. ej., en hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del factor XI, deficiencia del factor VII, trombocitopenia, o enfermedad de...

1. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de ácido siálico; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

2. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 1-7% de las cadenas de oligosacáridos tienen una carga neutra; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

3. Preparación según la reivindicación 1 en donde dicha pluralidad de polipéptidos del factor VII comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 6-16% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo de galactosa terminal.

4. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 11-23% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una galactosa terminal o residuo de N-acetilgalactosamina; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

5. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde al menos aproximadamente un 2% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en a1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

6. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los residuos siálicos en las cadenas de oligosacáridos están ligados a la galactosa mediante un enlace a2->3.

7. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los residuos de ácido siálico comprenden ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc).

8. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde los oligosacáridos comprenden fucosa ligada en a1->6 a una N-acetilglucosamina de núcleo.

9. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde entre aproximadamente un 95-98% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico.

10. Preparación tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde entre aproximadamente un 96-97% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico.

11. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde entre aproximadamente un 2-4% de las cadenas de oligosacáridos tienen una carga neutra.

12. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde entre aproximadamente un 8-12% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de galactosa terminal.

13. Preparación tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde entre aproximadamente 12-18% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una galactosa terminal o residuo de N-acetilgalactosami- na.

14. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde al menos aproximadamente un 5% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en a1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria.

15. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde al menos aproximadamente un 10% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en a1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria.

16. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde al menos aproximadamente un 20% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en a1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria.

17. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde al menos aproximadamente un 40% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en a1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria.

18. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde los polipéptidos tienen la secuencia de aminoácidos del Factor VII de tipo salvaje.

19. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde los polipéptidos son Factor VII de tipo salvaje.

20. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del factor VIIa que tienen la secuencia del factor VII de tipo salvaje, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo de ácido siálico; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia, comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

21. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del factor VIIa que tienen la secuencia del factor VII de tipo salvaje, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde al menos aproximadamente un 2% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en a1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

22. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en donde los polipéptidos se producen en una célula huésped seleccionada del grupo que consiste en células fúngicas, de insecto, y de vertebrado.

23. Preparación como se define en la reivindicación 22, en donde la célula huésped es una célula mamífera.

24. Preparación como se define en la reivindicación 23, en donde la célula mamífera es derivada de un hámster.

25. Preparación como se define en la reivindicación 24, en donde la célula de hámster es seleccionada del grupo que consiste de células CHO y células BHK.

26. Preparación como se define en la reivindicación 23, en donde la célula mamífera es derivada de un humano.

27. Preparación como se define en la reivindicación 26, en donde la célula humana es una célula HEK.

28. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 120% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

29. Preparación como se define en la reivindicación 29, en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 130% de la biodisponibilidad de dicha preparación de referencia.

30. Preparación como se define en la reivindicación 29, en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 140% de la biodisponibilidad de dicha preparación de referencia.

31. Fórmula farmacéutica que comprende una preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-30 y un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

32. Uso de una preparación que comprende polipéptidos del factor VII como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 para la preparación de un medicamento para tratar los trastornos de la coagulación.

33. Uso como se define en la reivindicación 32, en donde el trastorno de la coagulación es seleccionado del grupo que consiste en hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del factor XI, deficiencia del factor VII, trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand, cirugía, y traumatismo.

34. Uso de una preparación que comprende polipéptidos del factor VII como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 para la preparación de un medicamento para la prevención del sangrado indeseado.