Una formulación antigénica que comprende un capsómero de virus de papiloma humano para usar como una vacuna,

estando dicho capsómero compuesto de una proteína de fusión compuesta de proteína L1 de virus de papiloma humano, residuos de amino ácido adyacentes de una segunda proteína, donde la segunda proteína es un antígeno de tumor humano, un antígeno viral o antígeno bacterial, provocando dicha formulación una respuesta inmune la cual neutraliza los viriones del virus de papiloma humano donde dicho capsómero es obtenido por separación de partículas tipo virus

Formulaciones y formas de uso de la vacuna capsómero de virus de papiloma.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con formulaciones de vacunas que comprenden proteínas del virus del papiloma, como proteínas de fusión, proteínas truncadas, o proteínas de fusión truncadas. La invención adicionalmente abarca métodos para producir capsómeros de las formulaciones, como también métodos profilácticos y terapéuticos para su uso.

Antecedentes

Infecciones con ciertas cepas de alto riesgo de virus genital de papiloma en humanos (VPH) -por ejemplo. VPH 16, 18, o 45- se cree que son el principal factor de riesgo para la formación de tumores malignos del tracto anogenital. De las posibles malignidades, el carcinoma cervical es, con mucho, el más frecuente: de acuerdo a un estimado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), casi 500.000 nuevos casos de la enfermedad ocurren anualmente. Por la frecuencia con la cual ocurre esta patología, la conexión entre infección con VPH y carcinoma cervical ha sido extensivamente examinada, llevando a numerosas generalizaciones.

Por ejemplo, se conocen lesiones precursoras de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) por ser causadas por infecciones con el virus del papiloma [Crum, New Eng. J. Med. 310.880-883 (1984)]. ADN de los genomas de ciertos tipos de VPH, incluyendo por ejemplo, cepas 16, 18, 33, 35, y 45, han sido detectados en mas de 95% de las biopsias de tumor de pacientes con esta enfermedad, como también en líneas celulares primarias cultivadas de los tumores. Se ha encontrado que aproximadamente 50 a 70% de las células tumorales NIC incluyen ADN derivado solo de VPH 16.

Los productos de proteínas de los genes tempranos de VPH 16 y VPH 18 E6 y E7 han sido detectados en líneas celulares de carcinoma cervical como también en queratinocitos humanos transformados in vitro [Wettstein, et al., en PAPILLOMA VIRUSES AND HUMAN CANCER, Pfister (Ed.),CRC Press: Boca Raton, FL 1990 pp 155-179] y un porcentaje significativo de pacientes con carcinoma cervical tienen anticuerpos anti-E6 o anti-E7. Se ha mostrado que las proteínas E6 y E7 participan en inducción de síntesis de ADN celular en células humanas, transformación de queratinocitos humanos y otros tipos de células, y formación de tumores en ratones transgénicos [Arbelt, et al., J. Virol. , 68:4358-4364 (1994): Auewarakul, et al., Mol. Cell. Biol. 14:8250-8258 (1994); Barbosa. et al., J. Virol. 65:292-298 (1991); Kaur, et al., J. Gen. Virol. 70:1261-1266 (1989): Schlegel, et al., EMBO J., 7:3181-3187 (1988)]. La expresión constitutiva de las proteínas E6/E7 parece ser necesaria para mantener la condición transformada de tumores VPH-positivos.

A pesar de la capacidad de algunas cepas VPH para inducir fenotipos neoplásicos in vivo e in vitro, todavía otros tipos de VPH causan verrugas genitales benignas tales como Condylomata acuminata y son solo raramente asociados con tumores malignos [Ikenberg. In Gross, et al., (eds.) GENITAL PAPILLOMAVIRUS INFECTIONS. Springer Verlag: Berlin, pp., 87-112]. Cepas de bajo riesgo de este tipo incluyen, por ejemplo, VPH 6 y 11.

Más a menudo, los virus del papiloma genital humano son transmitidos entre humanos durante el coito, lo cual en muchos casos, conlleva a la infección persistente en la membrana mucosa anogenital. Mientras esta observación sugiere que la infección primaria induce una respuesta inmune inadecuada o que el virus ha desarrollado la habilidad de evadir la vigilancia inmune, otras observaciones sugieren que el sistema inmune está activo durante la manifestación primaria como también durante la progresión maligna de infecciones del virus del papiloma [Altmann et al. en VIRUSES AND CANCER, Minson et al., (eds.) Cambridge University Press, (1994) pp. 71-80].

Por ejemplo, la manifestación clínica de la infección primaria con virus de papiloma de conejo o bovino puede ser prevenida con vacunación con extractos de verrugas o proteínas estructurales virales [Altmann, et al., supra; Campo, Curr. Top. En Microbiol and Immunol. 186:255-266 (1994); Yindle and Frazer, Curr. Top. En Microbiol. and Immunol. 186;217-253 (1994)]. Roedores previamente vacunados con recombinantes vaccinia que codifican proteínas tempranas VPH 16 E6 o E7, o con péptidos E6 o E7 sintéticos, son de la misma forma protegidos de la formación de tumores después de la inoculación de células transformadas autólogas VPH 16 [Altman, et al., supra; Campo, et al., supra; Yindle and Frazer, et al. supra]. La regresión de las verrugas puede ser inducida por la transferencia de linfocitos de animales regresores seguida de infección por virus de papiloma animal. Finalmente, en pacientes inmunosuprimidos, tales como, por ejemplo, receptores de transplantes de órganos o individuos infectados con VIH, la incidencia de verrugas genitales, NIC, y cáncer anogenital es elevada.

DE4435907A y Virology 234, 1997, páginas 93-111 revela varios métodos para producir partículas tipo virus VPH. W09531476A revela el uso de un polipéptido sintético durante la preparación de una proteína de fusión L1 recombinante.

Hasta la fecha, no se han descrito vacunas de VPH que comprendan el virus del papiloma humano proteína L1 tardía en la forma de capsómeros que sean adecuados para propósitos profilácticos y terapéuticos. Ya que la proteína L1 no está presente en lesiones genitales malignas, la vacunación con la proteína L1 no tiene ningún potencial terapéutico para estos pacientes. La construcción de proteínas quiméricas, que comprende residuos de amino ácidos de la proteína L1 y, por ejemplo proteína E6 o E7, lo que da lugar a capsómeros quiméricos, combina funciones profilácticas y terapéuticas de una vacuna. Un método para producción de alto nivel de capsómeros quiméricos sería por lo tanto particularmente deseable, en vista de las posibles ventajas ofrecidas por tal vacuna para intervención profiláctica y terapéutica.

Por lo tanto existe una necesidad en la técnica para proveer formulaciones de vacunas que puedan prevenir o tratar infección con VPH. Métodos para producir formulaciones de vacuna que superen los problemas conocidos en la técnica por ser asociados con la expresión y purificación de la proteína VPH recombinante sería manifiestamente útil para tratar la población de individuos ya infectados con VPH como también sería útil para inmunizar la población de individuos susceptibles a la infección con VPH.

Resumen de la invención

La presente invención provee formulaciones terapéuticas y profilácticas de la vacuna que comprenden capsómeros de papiloma humano quiméricos. La invención también provee métodos terapéuticos para tratar pacientes infectados con VPH como también métodos profilácticos para prevenir la infección por VPH en un individuo susceptible. Métodos para la producción y purificación de capsómeros y proteínas de la invención también son contemplados.

En un aspecto de la invención, se consideran las vacunaciones profilácticas para la prevención de la infección con VPH las cuales incorporan las proteínas estructurales L1 y L2 del virus del papiloma. El desarrollo de una vacuna de este tipo enfrenta obstáculos significativos porque los virus del papiloma no pueden ser propagados a titulaciones adecuadas en cultivos celulares u otros sistemas experimentales para proveer las proteínas virales en suficiente cantidad para una producción económica de la vacuna. Además, metodologías recombinantes para expresar las proteínas no son siempre sencillas y usualmente resultan en un bajo rendimiento de proteína. Recientemente han sido descritas partículas tipo-virus (VLPs), similares en conformación a estructuras cápsidas virales, las cuales son formadas en células Sf-9 de insecto en la expresión de proteínas virales L1 y L2 (o L1 por sí sola) usando vaccinia recombinante o baculovirus. La purificación de los VLPs puede ser lograda muy simplemente por medio de centrifugación en CsCl o gradientes de sacarosa [Kimbauer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 99:12180-12814 (1992): Kirnbaurer, et al., J. Virol. 67:6929-6936 (1994); Proso, et al., J. Virol. 6714:1936-1944 (1992): Sasagawa, et al., Virology 2016:126-195 (1995): Volpers, et al., J. Virol. 69: 3258-3264 (1995); Zhou, et al., J. Gen. Virol. 74:762-769 (1993): Zhou, et al., Virology 185:251-257 (1991)].WO93/02184 describe un método en el cual partículas tipo virus de papiloma (VLPs) son usadas para aplicaciones diagnósticas o como...

1. Una formulación antigénica que comprende un capsómero de virus de papiloma humano para usar como una vacuna, estando dicho capsómero compuesto de una proteína de fusión compuesta de proteína L1 de virus de papiloma humano, residuos de amino ácido adyacentes de una segunda proteína, donde la segunda proteína es un antígeno de tumor humano, un antígeno viral o antígeno bacterial, provocando dicha formulación una respuesta inmune la cual neutraliza los viriones del virus de papiloma humano donde dicho capsómero es obtenido por separación de partículas tipo virus.

2. Una formulación antigénica que comprende un capsómero de virus de papiloma humano para ser usado como una vacuna, estando dicho capsómero compuesto de una proteína de fusión compuesta de proteína L1 de virus de papiloma humano, residuos de amino ácido adyacentes de una segunda proteína, donde la segunda proteína es un antígeno de tumor humano, un antígeno viral o antígeno bacterial, provocando dicha formulación una respuesta inmune la cual neutraliza los viriones del virus de papiloma humano donde dicho capsómero es obtenido por el desensamblaje de partículas tipo virus.

3. La formulación antigénica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 donde la proteína L1 es codificada en el genoma de un virus de papiloma humano seleccionado del grupo que consiste de VPH6, VPH11, VPH16, VPH18, VPH33, VPH35, y VPH45.

4. La formulación antigénica de acuerdo con la reivindicación 3 donde el virus de papiloma es VPH16.

5. La formulación antigénica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 donde los residuos de amino ácido de la segunda proteína son derivados de una proteína VPH.

6. La formulación antigénica de acuerdo con la reivindicación 5 donde la proteína VPH es una proteína VPH temprana.

7. La formulación antigénica de acuerdo con la reivindicación 6 donde la proteína VPH temprana es seleccionada de un grupo que consiste de E1, E2, E3, E4, E5, E6, y E7.

8. El uso de la formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de infección con VPH y enfermedades relacionadas a éste.

9. El uso de la formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la producción de una composición farmacéutica para la prevención de infección con VPH y enfermedades relacionadas a éste.