FACTORES ACTIVADORES DEL PLASMINOGENO NO NEUROTOXICOS PARA EL TRATAMIENTO TERAPEUTICO DE APOPLEJIAS.

El uso de un mutante de un factor activador del plasminógeno, cuya especificidad por la fibrina está elevada en comparación con el t-PA de tipo natural, para producir un medicamento para el tratamiento terapéutico de la apoplejía en seres humanos tres horas después del inicio de la apoplejía, sin la combinación con un agente terapéutico adicional

Factores activadores del plasminógeno no neurotóxicos para el tratamiento terapéutico de apoplejías.

La invención se refiere al uso terapéutico de activadores del plasminógeno no neurotóxicos, en particular de la saliva de Desmodus rotundus (DSPA) para el tratamiento de una apoplejía.

"Apoplejía" es un término colectivo para diversos síndromes que tienen síntomas clínicos similares. Se puede hacer una diferenciación inicial de estos síndromes en las denominadas lesiones isquémicas y lesiones hemorrágicas basándose en la patogénesis particular.

Las lesiones isquémicas (isquemia) implican una reducción o interrupción de la circulación sanguínea en el cerebro como resultado de un riego sanguíneo arterial inadecuado. Esto está provocado a menudo por la trombosis de un vaso con estenosis arterioesclerótica, pero también por embolias arterio-arteriales o cardiacas.

Por otra parte, las lesiones hemorrágicas se atribuyen, entre otras causas, a la perforación de las arterias que irrigan el cerebro dañadas por la hipertensión arterial. Sin embargo, solamente alrededor del 20% de todas las lesiones cerebrales están provocadas por esta forma de hemorragia, de manera que las apoplejías provocadas por la trombosis son con mucho las más importantes.

La isquemia del tejido neuronal va acompañada hasta cierto punto por la necrosis de las células afectadas, en comparación con las isquemias de otros tejidos. La incidencia incrementada de la necrosis se puede explicar de acuerdo con la comprensión reciente del fenómeno de la denominada excitotoxicidad, que es una cascada compleja de un gran número de etapas de reacción. Esta se desencadena, por tanto, por las neuronas isquémicas que están sufriendo la deficiencia de oxígeno y que pierden rápidamente ATP y se despolarizan. Esto conduce a una liberación postsináptica incrementada del neurotransmisor glutamato, el cual a su vez activa los receptores de glutamato asociados a membrana, que regulan los canales de cationes. Como consecuencia de la secreción incrementada de glutamato, no obstante, los receptores de glutamato están hiperactivados.

Los reguladores de glutamato a su vez regulan los canales de cationes dependientes del potencial, que se abren cuando el glutamato se une a su receptor. Por lo tanto, comienza la entrada de Na⁺ y Ca²⁺ a la célula, lo que conduce a una gran alteración del metabolismo celular dependiente del Ca²⁺, lo que incluye el metabolismo energético. En este contexto, la activación de las enzimas catabólicas dependientes del Ca²⁺ en particular podría ser responsable de la muerte celular que se da posteriormente (Lee, Jin-Mo et al., "The changing landscape of ischemic brain injury mechanisms"; Dennis W. Zhol "Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system").

Aunque el mecanismo de la neurotoxicidad mediada por glutamato no se comprende todavía con detalle, parece, sin embargo, haber unanimidad en que este fenómeno contribuye en un grado considerable a la muerte de las células neuronales tras la isquemia cerebral (Jin-Mo Lee et. al.).

Junto con la protección de las funciones vitales y la estabilización de los parámetros fisiológicos, los esfuerzos para reabrir el vaso ocluido son de gran importancia en la terapia de la isquemia cerebral aguda. Se intenta lograr este objetivo mediante diversas aproximaciones. La reapertura puramente mecánica todavía no ha alcanzado resultados satisfactorios, tal como, por ejemplo, la PTCA tras un infarto de miocardio. Hasta ahora solamente ha sido posible demostrar una mejora adecuada del estado del paciente con una fibrinolisis eficaz. Esta se puede llevar a cabo mediante la aplicación local por medio de un catéter (PROCAT, un estudio con pro-uroquinasa), pero a pesar de los resultados positivos iniciales, este método todavía no ha conducido a la aprobación de una sustancia farmacéutica.

La fibrinolisis endógena se basa en la actividad proteolítica de la serin proteasa plasmina, que se origina a partir del precursor inactivo plasminógeno mediante catálisis (activación). La activación natural del plasminógeno es llevada a cabo por los activadores endógenos del plasminógeno u-PA (activador del plasminógeno de tipo uroquinasa) y t-PA (activador del plasminógeno tisular). Este último forma, en contraste con u-PA, el denominado complejo activador junto con la fibrina y el plasminógeno. La actividad catalítica del t-PA es, por lo tanto, dependiente de la fibrina y experimenta un incremento de aproximadamente 550 veces en presencia de fibrina. Junto con la fibrina, el fibrinógeno puede estimular también la catálisis mediada por t-PA de la plasmina a plasminógeno, aunque en un grado mucho menor. La actividad de t-PA experimenta así solamente un incremento de 25 veces en presencia de fibrinógeno. Los productos de escisión de la fibrina (productos de degradación de la fibrina (FDP)), a su vez, estimulan de manera similar la actividad de t-PA.

Las aproximaciones anteriores al tratamiento trombolítico de la apoplejía aguda se remontan a la década de 1950. Sin embargo, los primeros estudios clínicos exhaustivos con estreptoquinasa, un agente fibrinolítico de estreptococos beta-hemolíticos, se llevaron a cabo a partir del año 1995. La estreptoquinasa forma un complejo con el plasminógeno que es capaz de convertir otras moléculas de plasminógeno en plasmina.

Sin embargo, la terapia con estreptoquinasa está asociada a desventajas considerables, ya que como proteasa bacteriana la estreptoquinasa puede desencadenar reacciones alérgicas en el organismo. También puede existir la denominada resistencia a estreptoquinasa en caso de una infección previa por estreptococos con la formación correspondiente de anticuerpos, lo que dificulta la terapia. Los estudios clínicos en Europa (Multicenter Acute Stroke Trial of Europe (MAST-E), Multicenter Acute Stroke Trial of Italy (MAST-I)) y Australia (Australian Streptokinase Trial (AST)) indicaron además un riesgo tan incrementado de mortalidad y el riesgo considerable de hemorragia intracerebral (hemorragia intracerebral, HIC) tras el tratamiento de los pacientes con estreptoquinasa, que estos estudios se tuvieron que suspender prematuramente.

En una aproximación terapéutica alternativa, se administra uroquinasa, de forma similar a un fibrinolítico "convencional", y esta no tiene propiedades antigénicas, en contraste con la estreptoquinasa, ya que es una enzima endógena que se da en numerosos tejidos. Es un activador independiente de cofactores del plasminógeno. La uroquinasa se produce en cultivos de células renales.

Existe una experiencia extensa en el campo de la trombolisis terapéutica con un activador del plasminógeno de tipo tisular, denominado rt-PA (véase el documento EP 0 093 619, memoria descriptiva de la patente de EE.UU. 4 766 075), que se produce en células recombinantes de hámster. En la década de 1990 se llevó a cabo una serie de estudios clínicos en todo el mundo con t-PA, además de la indicación principal de infarto agudo de miocardio, con resultados que en algunos casos todavía no se comprenden y son contradictorios. Así, en el denominado European Acute Stroke Trial (ECASS) los pacientes se trataron primero de manera intravenosa con rt-PA en un período de seis horas tras el inicio de los síntomas de apoplejía, y se investigó la tasa de mortalidad y el índice de Barthel, como medida de la incapacidad o capacidad de vida independiente del paciente, después de 90 días. En este caso los resultados fueron la ausencia de una mejora significativa de la capacidad de vida, y sin duda alguna un incremento de la mortalidad, aunque no significativo. Esto llevó a la conclusión de que podría ser ventajoso el tratamiento trombolítico de pacientes seleccionados individualmente de una manera específica según el historial del caso particular con rt-PA inmediatamente tras el inicio de la apoplejía posiblemente. Basándose en el riesgo incrementado de hemorragia intracerebral (HIC) observada después de sólo unas horas tras el inicio de la apoplejía, sin embargo, no se recomendó el uso general de rt-PA en el período investigado de seis horas tras el inicio de la apoplejía (véase C. Lewandowski C y Wiliam Barsan, 2001: Treatment of Acute Stroke; en: Annals of Emergency Medicine 37:2; pág. 202 y sigs.).

El tratamiento trombolítico de la apoplejía, de manera similar, fue objeto más tarde de un estudio clínico del National Institute of Neurologic Disorder and Stroke (denominado NINDS rtPA Stroke Trial)...

1. El uso de un mutante de un factor activador del plasminógeno, cuya especificidad por la fibrina está elevada en comparación con el t-PA de tipo natural, para producir un medicamento para el tratamiento terapéutico de la apoplejía en seres humanos tres horas después del inicio de la apoplejía, sin la combinación con un agente terapéutico adicional.

2. El uso de un factor activador del plasminógeno según la reivindicación 1, caracterizado por el tratamiento terapéutico de una apoplejía en humanos después de que hayan pasado seis horas desde el inicio de la apoplejía.

3. El uso de un factor activador del plasminógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el tratamiento terapéutico de una apoplejía en seres humanos después de que hayan pasado nueve horas desde el inicio de la apoplejía.

4. El uso de un factor activador del plasminógeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el factor activador del plasminógeno comprende al menos un residuo de histidina o serina, que junto con un residuo de aspartato forma al menos una parte de una tríada de zimógeno.

5. El uso de un factor activador del plasminógeno según la reivindicación 4, caracterizado porque el factor activador del plasminógeno se selecciona del grupo de los siguientes mutantes de t-PA: t-PA/R275E; t-PA/R275E, F305H; t-PA/R275E, F305H, A292S.

6. El uso de un factor activador del plasminógeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el factor activador del plasminógeno tiene una mutación puntual del Asp194, que reduce la estabilización de la conformación catalíticamente activa del factor activador del plasminógeno en ausencia de fibrina.

7. El uso según la reivindicación 6, caracterizado porque Asp194 se sustituye por glutamato o asparagina.

8. El uso de un factor activador del plasminógeno según la reivindicación 1, caracterizado porque el factor activador del plasminógeno tiene al menos una mutación en su bucle de autolisis, que reduce la formación de interacciones funcionales entre el plasminógeno y el factor activador del plasminógeno en ausencia de fibrina.

9. El uso según la reivindicación 8, caracterizado por al menos una mutación en el bucle de autolisis en las posiciones de los aminoácidos 420 a 423 de t-PA de tipo natural o en las posiciones que son homólogas a estas.

10. El uso según la reivindicación 9, caracterizado por una mutación seleccionada del grupo de los siguientes mutantes: L420A, L420E, S421 G, S421 E, P422A, P422G, P422E, F423A y F423E.

11. El uso de un factor activador del plasminógeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el factor activador del plasminógeno en forma de zimógeno tiene al menos una mutación puntual que evita la catálisis por la plasmina.

12. El uso de un factor activador del plasminógeno según la reivindicación 11, caracterizado porque la mutación puntual está localizada en las posiciones 15 ó 275 del t-PA o en posiciones que son homólogas a estas.

13. El uso según la reivindicación 12, caracterizado por el glutamato en la posición 15 ó 275.

14. El uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el factor activador del plasminógeno tiene una mutación puntual en la posición 194, que reduce la estabilización de la conformación catalíticamente activa del factor activador del plasminógeno en ausencia de fibrina.

15. El uso según la reivindicación 14, caracterizado por una Phe194.

16. El uso según la reivindicación 1, caracterizado por un factor activador del plasminógeno con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ. ID No. 1.

17. El uso según la reivindicación 1, caracterizado por un factor activador del plasminógeno con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ. ID No. 2.