Procedimiento para determinar la presencia o el efecto de un componente en una muestra,

utilizando un sistema de agregación que comprende partículas a las que se unen un componente de unión, cuyas partículas comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y absorben la luz en el infrarrojo, y cualquier reactivo adicional necesario para la agregación de dichas partículas, comprendiendo dicho procedimiento:

combinar una muestra con dicho sistema de agregación para formar una mezcla de ensayo;

irradiar dicha mezcla de ensayo con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de la luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en donde el nivel de transmisión o un cambio en dicho nivel de transmisión a través del tiempo se relaciona con la presencia del componente en dicha muestra

Ensayos aglutrimétricos en sangre.

Introducción

La industria médica se ha convertido cada vez más dependiente de técnicas de medición de diversas entidades en los fluidos fisiológicos con el fin de poder determinar el estado de salud de un individuo, el nivel de dosis de fármacos, el uso de drogas ilegales, las secuencias genómicas, etc. Por lo tanto, la capacidad de tomar una muestra fisiológica y analizar rápidamente la presencia de un componente particular ha hecho tratamientos médicos más eficaces y cada vez más exitosos.

En muchos casos, se desea utilizar sangre entera como fuente para el diagnóstico de la salud de un paciente o para controlar la eficacia de los fármacos que se han administrado al paciente. Sin embargo, la sangre como fuente para la determinación de estos parámetros tiene muchas deficiencias. Entre las deficiencias cuando se utiliza directamente, o incluso cuando se diluye con tampón, son: la sangre se coagula rápidamente, la sangre contiene una gran cantidad de sustancias que absorben luz y fluorescentes, la sangre muestra variaciones en su composición, sus características pueden cambiar en relación con los reactivos utilizados en los ensayos; y la sangre muestra variaciones en presencia o ausencia de oxígeno. Aunque estas propiedades complican el uso de la sangre como muestra para fines de diagnóstico, se han empleado diversas técnicas para reducir o eliminar estos problemas, como, por ejemplo, alta dilución, la adición de anticoagulantes, la separación de la sangre del plasma y sus componentes celulares, y similares. Durante estas manipulaciones, sin embargo, debe tenerse un gran cuidado para evitar la lisis de las células rojas de la sangre para evitar la liberación de la hemoglobina, que puede interferir con los ensayos de diagnóstico. A pesar de los problemas asociados con el uso de sangre como medio de la muestra, en muchos casos, la sangre es la única fuente que proporciona la información de interés. Por lo tanto, es muy deseable la identificación de formas de utilización de sangre completa, mientras se disminuye la interferencia de sus componentes.

Hay, por tanto, un interés sustancial en la elaboración de nuevos enfoques para el uso y la manipulación de la sangre con fines de diagnóstico. Un área que es de particular interés es el uso de la sangre para la evaluación de la función de las plaquetas. El papel de las plaquetas en la fisiología de los mamíferos es extraordinariamente diverso, pero su papel principal es promover la formación de trombos. En muchas situaciones, se desea evaluar la capacidad de coagulación de la sangre, un parámetro que está con frecuencia mediado por la capacidad de las plaquetas a adherirse y/o agregarse. Así, se podrían evaluar las funciones adhesivas de las plaquetas. Por ejemplo, uno podría saber si la administración de fármacos bloquea o promueve la formación de coágulos, o que uno pueda necesitar detectar deficiencias en la función de las plaquetas antes de procedimientos quirúrgicos. En otros casos, uno puede estar interesado en evaluar la eficacia de un inhibidor de plaquetas que se está probando, como un nuevo medicamento, o se utiliza como tratamiento clínico aprobado en un paciente. Nuevas pruebas de diagnóstico para la realización de lo anterior, por lo tanto, serían útiles.

La patente US 5.455.228 y la solicitud PCT WO96/10749 describen un ligando resistente a péptidos y un ensayo de bloqueo de plaquetas, respectivamente. Véase también, Coller, B.S. Platelets in cardiovascular thrombosis and thrombolysis. En: Fozzard et al., Eds. The Heart and Cardiovascular System, 2a ed., New York, NY: Raven Press, 1992:219-273. Para una descripción de los tintes de absorción de infrarrojos, consulte Fabian et al., Chem. Rev. 92:1196-1226 (1992).

Otras técnicas que han sido descritas para la determinación de plaquetas y/o de la función de las plaquetas son: Las solicitudes PCT WO94/12664; WO94/22018; WO92/08982; WO89/00200; las patentes US 5.427.913; 5.306.632; 5.523.238; 5.266.462; 5.246.832; 5.114.842 y EP-A-0165 68. Artículos de interés incluyen: Beer et al., Immobilized Arg-Gly-Asp (RGD) peptides of variyng lengths as structural probes of the platelet glycoprotein IIb/IIIa receptor. Blood 79:117-128 (1992). Coller et al., Collagen-platelet interactions: Evidence for a direct interaction of collagen with platelet GPIa/IIa and an indirect interaction with platelet GPIIb-IIIa mediated by adhesive proteins. Blood 74:182-192 (1989); Coller et al., Studies of activated GPIIb-IIIa receptor son the luminal surface of adherent platelets. J. Clin Invest. 92:2796-2806 (1993), y Pfueller et al., Role of plasma proteins in the interaction of human platelets with particles. Thrombosis Research 12:979-990 (1978).

US 497 3669 describe ensayos de aglutinación de partículas que utilizan técnicas de absorción limitada.

Descripción de la invención

Se describe un ensayo aglutimétrico que emplea partículas que absorben luz en la región infrarroja. La agregación de las partículas se detecta por los cambios en la absorción de infrarrojos de los medios de la muestra. El ensayo se puede utilizar para determinar la presencia de un componente de interés, la función de dicho componente, o para determinar la cantidad del componente. La metodología permite el uso de sangre completa o de sangre ligeramente diluida, en lugar de plasma. El procedimiento consiste en mezclar los reactivos de las partículas, los reactivos adicionales, según proceda, y la muestra y luego medir el cambio en la absorción de la luz infrarroja del medio. El resultado puede ser comparado con controles para la determinación cuantitativa.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que representa el efecto de la oxigenación de la sangre en los índices de referencia obtenidos con las partículas que absorben en el intervalo visible, o en el intervalo infrarrojo. Debido a que la oxigenación de la sangre cambia el perfil de absorción de la hemoglobina, lo que altera la absorción de la sangre en el intervalo visible, no hay interferencia en el ensayo. Por lo tanto, con cuentas azules la oxigenación de la sangre provoca un aumento artificial en los índices de aglutinación observados. En cambio, utilizando partículas que absorben la luz en la gama de infrarrojos, la oxigenación de la sangre no tiene ningún efecto. Por lo tanto, los índices que se indican son independientes de la oxigenación de la sangre.

La figura 2 es un gráfico de los resultados de un rápido análisis de la función de las plaquetas (RPFA) del compuesto Searle 54701B. El RPFA se llevó a cabo y la actividad máxima se determinó según lo descrito en la sección experimental. Los resultados individuales de media y de seis donantes por separado se muestran en la misma y en la figura siguiente.

La figura 3 es una gráfica de los resultados de la prueba de agregación óptica de las plaquetas del compuesto Searle 54701B utilizando agonista ADP 20µM. La agregación óptica de las plaquetas se realizó como se describe en la sección experimental. Los resultados que se muestran son los datos de pendiente máxima (% de variación de agregación/minuto) y no son valores normalizados.

La figura 4 es un gráfico que compara los resultados de la agregación de las plaquetas obtenidos mediante un sistema disponible comercialmente (agregometría de plaquetas) trazada respecto a la actividad de las plaquetas obtenida con RPFA. Se muestran dos paneles, cada uno representando la RPFA realizada con un conjunto diferente de las partículas de teñido. En el panel superior, las partículas se absorben en el intervalo de infrarrojos. En el panel de abajo, las partículas se absorben en el intervalo visible. Los datos en el gráfico superior son el error estándar de la media y el obtenido de la curva dosis-respuesta realizado en los valores de seis sujetos durante tres días. El coeficiente de correlación es del 0,99 y no hay sesgo mínimo (0,4%). Los datos en el gráfico de fondo son de un experimento realizado en la misma forma con cuentas teñidas con un tinte azul. El coeficiente de correlación es de 0,94 y hay un sesgo significativo (10,7%).

La figura 5 es un gráfico que muestra la neutralización de los compuestos inhibidores GP IIb/IIIa, compuestos Searle 54701B y compuestas Searle 57101A, de antisuero de conejo que crecen en contra de los compuestos. Los resultados que se muestran son los datos de la pendiente normalizada (índice de referencia % cuando no se añade ningún fármaco ni...

1. Procedimiento para determinar la presencia o el efecto de un componente en una muestra, utilizando un sistema de agregación que comprende partículas a las que se unen un componente de unión, cuyas partículas comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y absorben la luz en el infrarrojo, y cualquier reactivo adicional necesario para la agregación de dichas partículas, comprendiendo dicho procedimiento:

combinar una muestra con dicho sistema de agregación para formar una mezcla de ensayo;

irradiar dicha mezcla de ensayo con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de la luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en donde el nivel de transmisión o un cambio en dicho nivel de transmisión a través del tiempo se relaciona con la presencia del componente en dicha muestra.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha muestra es sangre completa y dicha mezcla de ensayo tiene menos de aproximadamente 5 veces la dilución de dicha muestra de sangre.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha sangre completa comprende un anticoagulante que no interfiere con una actividad intrínseca de un componente de dicha muestra.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la luz infrarroja es de aproximadamente 800 nm.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de la irradiación se realiza en una longitud de onda que es igual a un punto isobéstico de dos componentes de dicha mezcla de ensayo.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las partículas son de un diámetro entre 0,1 y 50 µ.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dichas partículas están recubiertas de una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos RGD o KDG.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha proteína es fibrinógeno o factor de von Willebrands.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, donde las partículas son partículas de carbono.

10. Procedimiento para determinar la actividad adhesiva de las plaquetas en una muestra, utilizando un sistema de agregación que comprende las partículas que comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y luz que se absorbe en el infrarrojo y a las cuales está unido fibrinógeno, y cualesquiera reactivos adicionales, comprendiendo dicho procedimiento:

combinar una muestra de sangre que comprende de plaquetas con dicho sistema de agregación para formar una mezcla de ensayo;

irradiar dicha mezcla de ensayo con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de dicha luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en el que el nivel de transmisión o un cambio en dicho nivel de transmisión a través del tiempo está relacionado con la actividad de las plaquetas en dicha muestra.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho sistema de agregación comprende un compuesto activador de plaquetas.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, que comprende las etapas adicionales para un valor de control de:

combinar (1) una composición que comprende trombina, (2) partículas sin recubrimiento, y (3) partículas recubiertas de fibrinógeno, que se absorben en el infrarrojo, donde la concentración de partículas recubiertos es comparable a la concentración en dicha mezcla de ensayo, en la que se produce la agregación de dichas partículas recubiertas;

irradiar dicha mezcla de control con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en el que el nivel de transmisión es indicativo del valor de base, sin la participación de las plaquetas.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicha composición que comprende trombina comprende un oligopéptido que tiene la secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Pro.

14. Procedimiento según la reivindicación 10, que comprende las etapas adicionales para un valor de control de:

combinar (1) partículas recubiertas con membranas de plasma de plaquetas o un anticuerpo anti-fibrinógeno, (2) partículas sin recubrimiento, y (3) partículas recubiertas con fibrinógeno que se absorben en el infrarrojo, donde la concentración de las partículas recubiertas es comparable con la concentración en dicha mezcla de ensayo, con lo cual se produce la agregación de dichas partículas recubiertas:

irradiar dicha mezcla de control con luz en la región infrarroja, y

determinar la transmisión de luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en el que el nivel de transmisión es indicativo del valor de base, sin la participación de las plaquetas.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho anticuerpo anti-fibrinógeno es 4A5 que se genera en contra de un péptido inmunógeno para imitar el sitio de reticulación intermolecular en la cadena y de fibrina humana y reacciona con el fibrinógeno y oligopéptidos basados en fibrinógeno sintético.

16. Procedimiento para determinar la presencia de un ligando de interés, empleando un sistema de agregación que comprende partículas a las que están unidas un componente de unión, cuyas partículas comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y absorben luz en el infrarrojo, y cualquier reactivo adicional necesario para la agregación de dichas partículas, en donde dicho ligando modula la agregación de dichas partículas resultantes de dicho componente de unión, comprendiendo dicho procedimiento:

combinar una muestra con dicho sistema de agregación para formar una mezcla de ensayo;

irradiar dicha mezcla de ensayo con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de la luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en el que el nivel de transmisión o un cambio en dicho nivel de transmisión a través del tiempo se relaciona con la presencia de dicho ligando de interés en dicha muestra.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho ligando es una molécula de menos de 5kD.

18. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho ligando es una molécula de más de 10kD.

19. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dichas partículas son de un tamaño entre 0,1 y 50 µ.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dichas partículas son de un tamaño entre 2 y 8 µ.

21. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha muestra de sangre completa diluida por menos 5 veces y dicha luz infrarroja es de 800 pm 10 nm.

22. Procedimiento para determinar la presencia de un inhibidor de catalizador, utilizando un sistema de agregación que comprende partículas, que comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y que absorben luz en el infrarrojo, a las que se une un componente de unión y cualquier reactivo adicional necesario para la agregación de dichas partículas como resultado de la acción catalítica sobre un sustrato de dicho catalizador inhibido mediante dicho inhibidor de catalizador,

en el que dicho sustrato o el producto catalítico de dicho sustrato, en conjunción con dicho componente de unión modula la agregación de dichas partículas, comprendiendo dicho procedimiento:

combinar una muestra que comprende dicho catalizador con dicho sistema de agregación para formar una mezcla de ensayo;

irradiar dicha mezcla de ensayo con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de dicha luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en el que el nivel de transmisión o un cambio en dicho nivel de transmisión a través del tiempo se relaciona con la presencia de dicho inhibidor de catalizador de interés en dicha muestra.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicho tinte de absorción de infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en una bacterioclorina, una bacteriocloropitina, un tinte de meropolimetina, un benzoanuleno, una porfirina viníloga, un tinte de polimetina, un cianina y una merocianina.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicho tinte de absorción de infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en IR-132, IR-140, 1,1'-dietil-4,4'-yoduro de dicarbocianina, 1,1'-dietil-2,2'-yoduro de quinotricarbocianina, Vanadyl 3,10,17,24-tetra-terc-butil-1, 8, 15, 22-Tetrakis (dimetilamino)-29H, 31H-ftalocianina, IRA800, ProJet 830NP, 2,3-diciano-4-[4-(dimetilamino) fenilimino]-1,4-naftoquinona, 9-[4-(dimetilamino) feniletinil]-perclorato de tioxantenilio, 2-[4-(4-dimetilaminofenil)-1,3-butadienil]-4-fenil-1-perclorato de benzotiopilio, 2-[2-[2-cloro-3-[2-(1,3-dihidro-1,3,3-trimetil-2H-indol-2-iliden)etilideno]1-ciclohexen-1il]etenil]-1,3,3-trimetil-3H-perclorato de indolio, N-[4-[5-(4-dimetilaminofenil)-3-fenil-2-penten-4-in-1-iliden]-2,5-ciclohexadien-1-ilideno]-N, N-perclorato de dimetilamonio, N,N-dietil-N-[4-[1,5,5-Tris (4-dietilaminofenil)-2,4-pentadienilideno]-2,5-ciclohexadien-1-iliden]perclorato de amonio, 1-etil-4-[5-(1-etil-4(1H)-quinolinilideno)-1,3-pentadienil] quinolinio y yoduro de 1-etil-4-[3-cloro-5-9]-etil-4(1H)-yoduro de quinolinio.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dichas partículas son partículas basadas en biovidrio o basadas en polímeros orgánicos.

26. Equipo para su uso en un procedimiento según la reivindicación 1, comprendiendo dicho equipo:

partículas de un tamaño entre 0,1 a 50 µ, que comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y luz absorbente en el infrarrojo y que están unidas a un componente de unión; y por lo menos un constituyente adicional que es:

por lo menos un anticuerpo a un inhibidor GP IIb/IIIa;

un activador de plaquetas;

un Vacutainer que comprende un anticoagulante en una cantidad que inhibe la coagulación;

una mezcla de trombina y de partículas de un tamaño entre 0,1 y 50 µ, que absorben luz en el infrarrojo, y/o

un soporte de una mezcla de ensayo con una entidad de mezcla.

27. Equipo según la reivindicación 26, en el que dicho elemento de unión es fibrinógeno o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos RGD o KGD.

28. Equipo según la reivindicación 26, en el que dicho elemento de unión es fibrinógeno.

29. Equipo según la reivindicación 26, en el que dichas partículas a las que están unidas un componente de unión son partículas de carbono.

30. Equipo según la reivindicación 26, en el que dicho activador de plaquetas se selecciona entre el grupo que consiste en TRAP, iso-TRAP, ADP, colágeno, ácido araquidónico, y ristocetina.

31. Equipo según la reivindicación 26, en el que dicho anticoagulante es citrato.

32. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, en el que dichas partículas son partículas basadas en biovidrio o basadas en polímero orgánico.

33. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, en el que dicho tinte que absorbe infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en una una bacterioclorina, una bacteriocloropitina, un tinte de meropolimetina, un benzoanuleno, una porfirina viníloga, un tinte de polimetina, un cianina y una merocianina.

34. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, en el que dicho tinte de absorción de infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en IR-132, IR-140, 1,1'-dietil-4,4'-yoduro de dicarbocianina, 1,1'-dietil-2,2'-yoduro de quinotricarbocianina, Vanadyl 3,10,17,24-tetra-terc-butil-1, 8, 15, 22-Tetrakis (dimetilamino)-29H, 31H-ftalocianina, IRA800, ProJet 830NP, 2,3-diciano-4-[4-(dimetilamino) fenilimino]-1,4-naftoquinona, 9-[4-(dimetilamino) feniletinil]-perclorato de tioxantenilio, 2-[4-(4-dimetilaminofenil)-1,3-butadienil]-4-fenil-1-perclorato de benzotiopilio, 2-[2-[2-cloro-3-[2-(1,3-dihidro-1,3,3-trimetil-2H-indol-2-iliden)etilideno]1-ciclohexen-1il]etenil]-1,3,3-trimetil-3H-perclorato de indolio, N-[4-[5-(4-dimetilaminofenil)-3-fenil-2-penten-4-in-1-iliden]-2,5-ciclohexadien-1-ilideno] -N,N-perclorato de dimetilamonio, N,N-dietil-N-[4-[1,5,5-Tris (4-dietilaminofenil)-2,4-pentadienilideno]-2,5-ciclohexadien-1-iliden]perclorato de amonio, 1-etil-4-[5-(1-etil-4(1H)-quinolinilideno)-1,3-pentadienil] quinolinio y yoduro de 1-etil-4-[3-cloro-5-9]-etil-4(1H)-yoduro de quinolinio.

35. Composición de materia que comprende partículas de un tamaño entre 0,1 y 50 µ, que comprenden un tinte que absorbe infrarrojos y luz absorbente en el infrarrojo y que están unidas a un componente de unión.

36. Composición de materia según la reivindicación 35, en la que dicho tamaño es entre 2 y 8 µ.

37. Composición de materia según la reivindicación 35, en la que dicho elemento de unión es fibrinógeno o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos RGD o KGD.

38. Composición según la reivindicación 35, en la que dicha luz absorbida es 800 nm pm 10 nm.

39. Composición de materia según la reivindicación 35, en el que dichas partículas son partículas de carbono.

40. Composición que comprende partículas poliméricas de un tamaño entre 0,1 y 50 µ, que comprenden un tinte absorbente de infrarrojos y luz absorbente en el infrarrojo, en combinación con trombina.

41. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, en la que dichas partículas son partículas basadas en biovidrio o basadas en polímeros orgánicos.

42. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, en la que dicho tinte de absorción de infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en dicho tinte que absorbe infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en una una bacterioclorina, una bacteriocloropitina, un tinte de meropolimetina, un benzoanuleno, una porfirina viníloga, un tinte de polimetina, un cianina y una merocianina.

43. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, en la que dicho tinte de absorción de infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en IR-132, IR-140, 1,1'-dietil-4,4'-yoduro de dicarbocianina, 1,1'-dietil-2,2'-yoduro de quinotricarbocianina, Vanadyl 3,10,17,24-tetra-terc-butil-1, 8, 15, 22-Tetrakis (dimetilamino)-29H, 31H-ftalocianina, IRA800, ProJet 830NP, 2,3-diciano-4-[4-(dimetilamino) fenilimino]-1,4-naftoquinona, 9-[4-(dimetilamino) feniletinil]-perclorato de tioxantenilio, 2-[4-(4-dimetilaminofenil)-1,3-butadienil]-4-fenil-1-perclorato de benzotiopilio, 2-[2-[2-cloro-3-[2-(1,3-dihidro-1,3,3-trimetil-2H-indol-2-iliden)etilideno]1-ciclohexen-1il]etenil]-1,3,3-trimetil-3H-perclorato de indolio, N-[4-[5-(4-dimetilaminofenil)-3-fenil-2-penten-4-in-1-iliden]-2,5-ciclohexadien-1-ilideno] -N,N-perclorato de dimetilamonio, N,N-dietil-N-[4-[1,5,5-Tris (4-dietilaminofenil)-2,4-pentadienilideno]-2,5-ciclohexadien-1-iliden] perclorato de amonio, 1-etil-4-[5-(1-etil-4(1H)-quinolinilideno)-1,3-pentadienil] quinolinio y yoduro de 1-etil-4-[3-cloro-5-9]-etil-4(1H)-yoduro de quinolinio.