Dispositivo de ensayo que puede distinguir entre la leucemia de linfocitos T CCRF-CEM y el linfoma de linfocitos B Raji,

comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido, y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicho ensayo de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 y CD56

Ensayo para la detección de una pareja de unión.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a un ensayo para la detección de una pareja de unión. La presencia o ausencia de una pareja de unión puede utilizarse como indicador de un estado normal o de un estado de enfermedad o trastorno, o de la tendencia a que se desarrolle un estado de enfermedad o trastorno, o de la presencia de un tipo celular particular, o agente microbiano, vírico, parasitario u otro agente patogénico en un animal, especie de ave o planta, o de la presencia de una entidad química particular en una muestra, tal como una biblioteca química, espécimen biológico o muestra ambiental o biblioteca de expresión fágica. Se da a conocer en la presente invención una matriz de moléculas que presentan una pareja de unión en una muestra biológica procedente o derivada de dicho animal, especie de ave o planta, en la que el patrón de unión de las parejas de unión a las moléculas respectivas en la matriz, incluyendo la ausencia de unión o la densidad de interacción de la pareja, proporciona una indicación de un estado normal o estado de enfermedad o trastorno, o de la tendencia a que se desarrolle un estado de enfermedad o trastorno, o de la presencia de un tipo celular particular o agente microbiano, vírico, parasitario u otro agente patogénico. La pareja de unión puede encontrarse en una muestra química, ambiental o de biblioteca de expresión fágica, y el patrón de unión, incluyendo la ausencia de unión o la densidad de interacción de la pareja, es indicativo de la presencia, tipo y/o concentración de una pareja de unión particular o de una familia de parejas de unión. El ensayo resulta útil, inter alia, para la detección de cánceres y neoplasias, así como de trastornos no neoplásicos en animales, incluyendo seres humanos, así como en especies de ave y en plantas. El ensayo también resulta útil para detectar tipos celulares, agentes microbianos, víricos, parasitarios u otros agentes patogénicos y entidades químicas en muestras químicas, ambientales y de expresión fágica. Las moléculas de la matriz comprenden inmunoglobulinas que pueden interactuar con antígenos solubles unidos a células o con antígenos sintéticos particulares. El patrón de unión en la matriz, incluyendo la presencia, ausencia o nivel de unión a los antígenos respectivos, proporciona una indicación de la expresión de los antígenos sobre las células o de la expresión de los antígenos por parte de las mismas, que, a su vez, proporciona una indicación de la existencia de un estado normal o de un estado de enfermedad o trastorno, tal como cáncer, en un animal, especie de ave o planta. El patrón de unión también proporciona una indicación de la presencia y/o concentración de antígenos en una biblioteca química, en una muestra ambiental o en una biblioteca de expresión fágica.

Antecedentes de la invención

Al final de la descripción se recogen los datos bibliográficos de las publicaciones a las que hace referencia el autor de la presente memoria.

La creciente sofisticación de las técnicas inmunológicas está facilitando en gran medida la investigación y desarrollo en los campos médico, veterinario, hortícola y medioambiental. La especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno es de importancia fundamental. A través de esta interacción puede determinarse la expresión de genes codificantes de antígenos particulares.

Muchos estados de enfermedad en especies de aves, plantas y, en particular, animales, tales como seres humanos, presentan una base genética, y pueden caracterizarse a partir de cambios en los patrones y/o niveles de expresión de diversos genes. Por ejemplo, algunos cánceres están asociados a cambios de la expresión de oncogenes y genes de supresión tumoral. Además, los estados de enfermedad o trastornos asociados a cambios en el ciclo celular y en el desarrollo pueden atribuirse a cambios en la regulación transcripcional de genes particulares.

Aunque se encuentran disponibles varios ensayos genéticos para evaluar mutaciones, la identificación de determinados cambios genéticos no siempre puede ser directamente indicativa de un estado de enfermedad o trastorno.

Algunos cambios genéticos se expresan mediante alteraciones de antígenos de la superficie celular. Nuevamente, sin embargo, los intentos anteriores para desarrollar un ensayo diagnóstico para estados de enfermedad o trastornos complejos, tales como el cáncer, basados en la identificación de un único antígeno no siempre han tenido éxito.

Las leucemias y linfomas causan una mortalidad y morbilidad significativas en el ser humano. Estos cánceres resultan de la proliferación continua de células que de otro modo se encontrarían bloqueadas en diversos estadios de la diferenciación normal hacia tipos celulares especializados. Las leucemias surgen de células formadoras de sangre presentes en la médula ósea debido a mutaciones en cualquiera de los precursores en los diversos linajes de diferenciación (ver la figura 1). Los linfomas se desarrollan a partir de linfocitos o macrófagos en el tejido linfático.

Los linfocitos en la sangre periférica expresan un gran número de diferentes antígenos sobre sus membranas plasmáticas externas, muchos de los cuales son receptores de factores de crecimiento, interacciones célula-célula e inmunoglobulinas, moléculas para la adhesión celular o estimulación del complemento, enzimas y canales iónicos. Se ha desarrollado una nomenclatura sistemática única para clasificar los anticuerpos monoclonales contra los antígenos de superficie celular de los leucocitos en el ser humano, conocidos como grupo de antígenos de diferenciación (CD) (Kishimoto et al., 1997). Puede encontrarse información detallada sobre los antígenos CD en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/cd/index_molecules.htm. La expresión de estos antígenos de superficie celular permite distinguir entre diferentes tipos de células sanguíneas maduras presentes en el sistema circulatorio periférico.

Las células en la sangre periférica son producidas en la médula ósea mediante la proliferación y diferenciación en linajes específicos a partir de células madre precursoras mieloides o linfoides que expresan el antígeno de superficie CD34 (ver la figura 2).

En la actualidad, una leucemia se diagnostica basándose en la morfología, expresión de CD específicos, antígenos linfoides (LY) y mieloides (MY), actividades enzimáticas y anormalidades citogenéticas, tales como las translocaciones cromosómicas. El diagnóstico de la leucemia mieloide aguda (AML) se realiza, por ejemplo, utilizando dichos cuatro criterios. La expresión de hasta tres antígenos CD en células de leucemia en la actualidad se determina utilizando anticuerpos marcados fluorescentemente contra antígenos CD particulares mediante análisis de citometría de flujo. De esta manera, el cribado de células de leucemia de pacientes para la expresión de los 166 antígenos CD no resulta de utilización práctica mediante la utilización de esta laboriosa técnica. Recientemente, de Matos y Vale, (1996), han desarrollado un procedimiento de citometría de flujo para la cuantificación simultánea en una única medición de los tipos principales de linfocitos humanos y sus subgrupos. En este procedimiento, se incuban poblaciones mixtas de linfocitos humanos con anticuerpos monoclonales contra CD3, CD4, CD8, CD19 y CD56 conjugados con tres fluorocromos diferentes. La medición de las tres emisiones fluorescentes diferentes mediante citometría de flujo permite la cuantificación de los tipos principales de linfocitos humanos, linfocitos T y B y células asesinas naturales (NK). Debido a que la mayoría de citómetros de flujo únicamente pueden utilizar tres láseres diferentes simultáneamente para el análisis celular, este procedimiento representa la utilización actual máxima de esta técnica.

Chang (1983) preparó series ordenadas de tipo matriz de anticuerpos de diferentes especificidades sobre cubreobjetos de vidrio que actuaban a modo de minúsculos inmunoadsorbentes específicos para células que expresaban los antígenos correspondientes sobre su superficie. Este procedimiento se basó en observaciones anteriores de que las células son capaces de unirse a superficies recubiertas con anticuerpos específicos para los antígenos sobre la superficie de las células (Mage et al., 1977; Wysocki y Sato, 1978). Chang (1983), demostró la unión específica de células mononucleares de sangre periférica al anticuerpo de ratón antiHLA-A2 humano adsorbido sobre cubreobjetos de vidrio, y de timocitos...

1. Dispositivo de ensayo que puede distinguir entre la leucemia de linfocitos T CCRF-CEM y el linfoma de linfocitos B Raji, comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido, y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicho ensayo de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 y CD56.

2. Dispositivo de ensayo que puede diagnosticar leucemias, comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido; y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede diagnosticar leucemias, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42, CD45, CD56, CD57, CD95 y CD122.

3. Dispositivo de ensayo que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemias y linfomas, comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido; y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemias y linfomas, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42a, CD44, CD44v3-10, CD44v6, CD45, CD45RA, CD45RO, CD52, CD56, CD57, CD60, CD61, CD71, CD79a, CD95, CD103, CD117, CD122, CD154, GPA, HLA-DR, KOR, FMC7, mIgG1, mIgG2a, mIgG2b y mIgM.

4. Dispositivo de ensayo que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemia y de linfoma, comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido; y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre las células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemia y de linfoma, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42a, CD44, CD44v3-10, CD44v6, CD45, CD45RA, CD45RO, CD52, CD56, CD57, CD60, CD61, CD64, CD71, CD79a, CD79b, CD80, CD95, CD103, CD117, CD122, CD134, CD138, CD154, Kappa, Lambda, GPA, HLA-DR, KOR, FMC7, mIgG1, IgG2a y antiIg.

5. Dispositivo de ensayo que puede distinguir entre diferentes leucemias, comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido; y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede distinguir entre diferentes leucemias, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42a, CD45, CD45RA, CD45RO, CD52, CD56, CD57, CD60, CD61, CD71, CD79a, CD95, CD103, CD117, CD122, CD154, GPA, HLA-DR, KOR, FMC7, mIgG1 y antihIg.

6. Dispositivo de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el patrón de unión se detecta microscópicamente, bioquímicamente, histoquímicamente o inmunológicamente.

7. Dispositivo de ensayo según la reivindicación 6, en el que el patrón de unión se detecta microscópicamente.

8. Dispositivo de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las moléculas de inmunoglobulina son anticuerpos monoclonales.

9. Dispositivo de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las moléculas de inmunoglobulina son anticuerpos policlonales.

10. Método para distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji, que comprende poner en contacto una muestra biológica con el dispositivo de ensayo según la reivindicación 1, permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión sobre la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión en la matriz que puede distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji.

11. Método para diagnosticar leucemias, que comprende poner en contacto una muestra biológica con el dispositivo de ensayo según la reivindicación 2, permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión en la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión sobre la matriz que puede diagnosticar leucemias.

12. Método para diagnosticar diferentes tipos de leucemias y de linfomas, que comprende poner en contacto una muestra biológica con el dispositivo de ensayo según la reivindicación 3, permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión sobre la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión sobre la matriz que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemias y de linfomas.

13. Método para diagnosticar diferentes tipos de leucemia y de linfoma, que comprende poner en contacto una muestra biológica y el dispositivo de ensayo según la reivindicación 4, permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión sobre la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión sobre la matriz que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemia y de linfoma.

14. Método para distinguir entre diferentes leucemias, que comprende poner en contacto una muestra biológica con el dispositivo de ensayo según la reivindicación 5, permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión sobre la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión sobre la matriz que puede distinguir entre diferentes leucemias.

15. Utilización de un dispositivo de ensayo según la reivindicación 1, para distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji.

16. Utilización de un dispositivo de ensayo según la reivindicación 2, para el diagnóstico de leucemias.

17. Utilización de un dispositivo de ensayo según la reivindicación 3, para el diagnóstico de diferentes tipos de leucemia y de linfoma.

18. Utilización de un dispositivo de ensayo según la reivindicación 4, para el diagnóstico de diferentes tipos de leucemia y de linfoma.

19. Utilización de un dispositivo de ensayo según la reivindicación 5, para distinguir entre diferentes leucemias.