Un método para detectar TAFIa y TAFIai, pero no la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido de activación N-terminal de TAFI,

en una muestra, comprendiendo dicho método:

(i) poner en contacto dicha muestra con un inhibidor de la carboxipeptidasa (PTCI) en condiciones que permiten la unión de PTCI a TAFIa y TAFIai; y

(ii) detectar la unión de TAFI y TAFIai a PTCI

Ensayo de diagnóstico para determinar inhibidor de fibrinólisis activable por trombina (TAFI).

1. Campo de la invención

La invención se refiere a un ensayo de diagnóstico para medir selectivamente niveles de la forma de 35 kD del inhibidor de fibrinólisis activable por trombina (abreviadamente en lo sucesivo TAFIa y TAFIai por las expresiones inglesas Thrombin-Activatable Fibrinolisis Inhibitor) pero no la pro-enzima TAFI ni el péptido por activación N-terminal de TAFI.

2. Fundamento de la invención

Se necesita un equilibrio adecuado entre las actividades de coagulación y las cascadas fibrinolíticas tanto para proteger a los organismos de una excesiva pérdida de sangre por lesiones como para mantener el flujo sanguíneo dentro del sistema vascular. Se reconoce que las dos cascadas opuestas, la de coagulación y la fibrinolítica, comprenden una serie de conversiones de zimógenos en enzimas que terminan en las dos enzimas proteolíticas respectivas trombina y plasmina. Estas enzimas catalizan la formación y eliminación de fibrina dentro del sistema circulatorio. Los desequilibrios se caracterizan por tendencias hemorrágicas o trombóticas que pueden dar como resultado ataques cardiacos o ictus en el organismo.

El inhibidor fibrinolítica activable por trombina (TAFI) es un glicoproteína de 60 kD presente en plasma humano que modula la fibrinolisis in vivo. El TAFI presente en plasma es una forma de pro-enzima que es más eficazmente activada por escisión proteolítica en la Arg-92 con un complejo de trombina-trombomodulina. La forma pro-enzima de TAFI también puede ser activada por escisión proteolítica por otras enzimas proteolíticas incluyendo, pero sin limitación, trombina o plasmina. Por activación de la pro-enzima TAFI mediante escisión proteolítica con trombina-trombomodulina, se forma una enzima activa (TAFIa) de 35 kD con actividad similar a carboxipeptidasa. Esta molécula también ha sido denominada en la literatura científica como carboxipeptidasa B del plasma (abreviadamente PCPB por la expresión inglesa Plasma CarboxiPeptidase B), o plasma-carboxipeptidasa U (PCPU). El TAFIa pierde rápidamente su actividad enzimática a través de un proceso de inactivación dependiente de la temperatura (t_1/2 = 10 min. a 37ºC). La inactivación de TAFIa no se debe a un proceso proteolítico, sino más bien un cambio a-conformacional en la estructura de la proteína que puede ir seguido por un cambio en el espectro de fluorescencia de la proteína. La enzima TAFIa inactivada se denomina TAFIai (35 kD). La inactivación espontánea de TAFIa a TAFIai, que es dependiente de la temperatura, se cree que es el principal mecanismo mediante el cual la actividad de TAFIa se modula durante la fibrinólisis.

La modulación de la fibrinolisis ocurre cuando TAFIa escinde los residuos de arginina y lisina C-terminales de fibrina parcialmente degradada, inhibiendo con ello la estimulación de la activación del plasminógeno modulada por activador de plasminógeno tisular (abreviadamente t-PA por la expresión inglesa Tisular-Plaminogen Activator). El sistema fibrinolítico se activa principalmente por el t-PA que es proporcionado por las células dañadas en la pared de los vasos sanguíneos. El t-PA convierte el plasminógeno circulante en plasmina que es una proteasa activa y puede producir un lento aumento de la fibrinolisis o, cuando se combina con la fibrina, un rápido aumento de la fibrinolisis. El efecto del t-PA sobre la fibrinolisis puede ser bloqueado por una clase de inhibidores denominados inhibidores del activador de plasminógeno (abreviadamente PAI por la expresión inglesa Plasminogen Activator Inhibitor), de los cuales se han identificado varios.

La trombomodulina es un componente de la pared de los vasos sanguíneos que se une a la trombina y cambia su especificidad desde fibrinógeno a proteína C, dando como resultado una molécula que posee actividad anticoagulante, en lugar de pro-coagulante. El complejo trombina-trombomodulina cataliza la escisión de proteína C a proteína C activada, que da como resultado una sub-regulación de la cascada de coagulación inactivando proteolíticamente los co-factores esenciales, Factor Va y VIIIa. De este modo, el cuerpo regula la cascada de coagulación.

Estudios tales como los de Taylor et al., Thromb. Res. 37:639 (1985) han sugerido que la proteína C activada no sólo es un anticoagulante, sino también un pro-fibrinolítico, tanto in vivo como in vitro. Subsiguientemente, se determinó que la proteína C sólo parece pro-fibrinolítica porque impide la activación catalizada por trombina de un inhibidor de la fibrinolisis previamente desconocido, cuyo precursor se aisló del plasma y se denominó TAFI.

El TAFI se descubrió independientemente en tres diferentes laboratorios. Inicialmente apareció como una molécula inestable similar a la carboxipeptidasa B en suero humano y fue descrita por Hendriks et al., Biochim. Biophys. Acta 1034:86 (1990). Un año después se clonó el cDNA para la molécula, se describió su secuencia de aminoácidos, y se describió su activación por tripsina y sus propiedades enzimáticas para sustratos sintéticos de carboxipeptidasa B (véase la patente de EE.UU. 5.206.161). En 1994, Wang et al., (J. Biol. Chem. 269:15937 (1994)) aislaron la molécula activada y la denominaron carboxipeptidasa U ("U" aludiendo la letra U al término inglés unstable = inestable). Subsiguientemente, Nesheirn et al., (J. Biol. Chem. 270:14477 (1995)) mostraron que la proteína era a la vez activada por trombina e inhibía la fibrinolisis, y denominaron TAFI a esta molécula. La co-identidad de PCPB, PCPU y TAFI se ha establecido por su comportamiento cromatográfico independiente en plasminógeno-Sepharose® y las secuencias de aminoácidos que están presentes en el sitio escisión para la activación.

El mecanismo de inhibición por TAFI de la fibrinolisis se puede describir esquemáticamente como se representa en la Figura 1.

La conversión de TAFI en TAFIa y subsiguientemente a TAFIai indica un proceso fibrinolítico en curso. Por lo tanto, la presencia de TAFIa y TAFIai en plasma es un marcador del proceso fibrinolítico. Las alteraciones de los niveles de TAFI han sido identificadas en cierto número de estados patológicos que incluyen enfermedades vasculares y cardíacas, enfermedades hepáticas, hemofilia, cáncer, leucemia e ictus. Por tanto, la cuantificación precisa de los niveles de TAFI, TAFIa y TAFIai en plasma proporciona información para la comprensión y diagnosis de muchas enfermedades en las que la fibrinolisis desempeña una función.

Están comercialmente disponibles diversos ensayos ELISA (ensayos con inmunosorbentes unidos a enzimas) que están diseñados para medir el nivel total de todas las formas de TAFI en plasma (por ejemplo, Imuclone TAFI 873 de American Diagnostica, Inc.; ELISA para TAFI de Affinity Biologicals). Se ha descrito un ensayo ELISA que solo mide la pro-enzima de TAFI de 60 kD (Stromquist et al., Thromb. Hemost 85:12-17 (2001)). Está comercialmente disponible un ensayo cromógeno basado en un ensayo funcional que sólo mide la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI (Actichrome 874 de American Diagnostica, Inc.).

La forma pro-enzima de TAFI de 60 kD comparte epítopos antigénicos comunes con TAFIa y TAFIai. No se han descrito anticuerpos que sean específicos para TAFIa y TAFIai pero tampoco para la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI. Por consiguiente, no se ha desarrollado un ensayo ELISA que específicamente mida TAFIa y TAFIai en presencia de la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI.

Serían útiles ensayos de diagnóstico selectivos para TAFIa y TAFIai en presencia de la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI para identificar y monitorizar cambios en el proceso fibrinolítico. Dichos cambios son indicativos de enfermedades en las cuales está implicado el proceso fibrinolítico tales como, enfermedades vasculares y cardíacas, enfermedades hepáticas, hemofilia, cáncer, leucemia e ictus. Por consiguiente, en la técnica existe la necesidad de ensayos eficaces selectivos para detectar y cuantificar niveles de TAFIa y TAFIai en presencia de la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI.

La cita o la identificación de cualquier referencia bibliográfica en este apartado no han de entenderse en el sentido de que dicha cita sea una técnica anterior a la presente solicitud.

3. Sumario de la invención

La...

1. Un método para detectar TAFIa y TAFIai, pero no la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido de activación N-terminal de TAFI, en una muestra, comprendiendo dicho método:

(i) poner en contacto dicha muestra con un inhibidor de la carboxipeptidasa (PTCI) en condiciones que permiten la unión de PTCI a TAFIa y TAFIai; y

(ii) detectar la unión de TAFI y TAFIai a PTCI.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de la carboxipeptidasa de la patata (PTCI) está inmovilizado en un soporte sólido.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el soporte sólido es una placa de microtitulación.

4. El método de la reivindicación 2, en donde el soporte sólido es una perla o micropartícula.

5. El método de la reivindicación 1, en donde dicha etapa de detección comprende poner en contacto dicha muestra con un agente que se une a, o es unido por, un complejo TAFIa/PTCI o un complejo TAFIai/PTCI.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicho agente es un anticuerpo monoclonal anti-TAFIa o anti-TAFIai.

7. El método de la reivindicación 1, en donde dicha etapa de detección comprende poner en contacto dicha muestra con un agente que se une al anticuerpo monoclonal anti-TAFIa o anti-TAFIai, estando dicho agente conjugado con HRP.

8. El método de la reivindicación 7, en donde dicho agente es conjugado IgG-HRP anti-ratón de asno.

9. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es un fluido biológico de un paciente.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el fluido biológico es plasma.

11. El método de la reivindicación 9, en donde el fluido biológico es sangre, orina, suero, semen o fluido cerebral o espinal.

12. El método de la reivindicación 9, en donde el paciente tiene un trastorno trombolítico.

13. El método de la reivindicación 9, en donde el paciente tiene un trastorno hemorrágico.

14. El método de la reivindicación 9, en donde el paciente está sometido a terapia anti-coagulante.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la terapia anti-coagulante es administración de activador de plasminógeno tisular (t-PA), activador de plasminógeno de uroquinasa (u-PA) o uno de sus análogos.

16. El método de la reivindicación 14, en donde dicha terapia anti-coagulante es administración de aspirina.

17. El método de la reivindicación 14, en donde dicha terapia anti-coagulante es administración de estreptoquinasa, estafiloquinasa, plasminógeno o sus análogos, heparina o heparina de bajo peso molecular.

18. El método de la reivindicación 9, en donde el paciente está sometido a terapia pro-coagulante.

19. El método de la reivindicación 18, en donde la terapia pro-coagulante es administración de ácido aminocaproico, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor VIIa, Factor IXa, proteína C activada, trombina, fibrinógeno o plasma crio-fraccionado.

20. El método de la reivindicación 9, en donde el paciente es susceptible de padecer un trastorno trombótico.

21. El método de la reivindicación 9, en donde es paciente es susceptible de padecer un trastorno hemorrágico.

22. El método de la reivindicación 1, en donde el límite inferior de detección de TAFIa y TAFIai en la solución es aproximadamente 0,1 µg/mL.

23. El método de la reivindicación 1, en donde el límite inferior de detección de TAFIa y TAFIai en la solución es aproximadamente 0,02 µg/mL.

24. El método de la reivindicación 1, en donde el límite inferior de detección de TAFIa y TAFIai en la solución es aproximadamente 0,002 µg/mL.

25. El método de la reivindicación 1, en donde el límite inferior de detección de TAFIa y TAFIai en la solución es aproximadamente 0,001 µg/mL.

26. Un kit que comprende en uno o más envases un soporte sólido revestido con PTCI inmovilizado, un patrón de TAFIa o TAFIai y un agente que se une a, o es unido por, un complejo TAFIa/PTCI o un complejo TAFIai/PTCI.

27. El kit de la reivindicación 26, que comprende sustrato del agente, una solución tampón y un agente de extinción.

28. El kit de la reivindicación 26, en donde el soporte sólido es una tira para un micropocillo.

29. El kit de la reivindicación 26, en donde el soporte sólido es una placa de microtitulación.

30. El kit de la reivindicación 26, en donde el soporte sólido es una perla o macropartícula.

31. El kit de la reivindicación 29, en donde el sustrato del agente que se une a, o es unido por, el complejo TAFIa/PTCI o un complejo TAFIai/PTCI es TMB.

32. Un método de diagnosticar un trastorno asociado a la fibrinólisis en un paciente, comprendiendo dicho método usar PTCI para medir específicamente el nivel de TAFIa y TAFIai, pero no la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido de activación N-terminal de TAFI en una muestra biológica de dicho paciente.

33. El método de la reivindicación 32, en donde el trastorno es un trastorno trombótico.

34. El método de la reivindicación 32, en donde el trastorno es un trastorno hemorrágico.

35. Un método de monitorizar un trastorno asociado con la fibrinólisis en un paciente, comprendiendo dicho método usar PTCI para medir específicamente el nivel de de TAFIa y TAFIai, pero no la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido de activación N-terminal de TAFI en una muestra biológica de dicho paciente.

36. El método de la reivindicación 35, en donde el trastorno es un trastorno trombótico.

37. El método de la reivindicación 35, en donde el trastorno es un trastorno hemorrágico.

38. El método de la reivindicación 5 o el kit de la reivindicación 28, en donde dicho agente es un anticuerpo anti-TAFIa o anti-TAFIai conjugado con peroxidasa de rábano silvestre (HRP).

39. El método de la reivindicación 8 o el kit de la reivindicación 29, en donde dicha etapa de detección comprende poner en contacto dicha muestra con un sustrato de peroxidasa de rábano silvestre (HRP).

40. El método de la reivindicación 39, en donde dicho sustrato de peroxidasa de rábano silvestre (HRP) es 3,3',5,5'-tetrametillencidina (TMB).

41. El método de las reivindicaciones 12, 20, 33 o 36, en donde el trastorno trombótico es un ataque cardiaco, ictus, enfermedad tromboembólica, infarto de miocardio agudo (AMI), trombosis venosa profunda, ataque isquémico agudo, embolismo pulmonar masivo, coagulación intravascular diseminada (DIC), síndrome anti-fosfolipídico, trombofilia familiar, sepsis púrpura trombocitopénica trombótica, artritis, hepatitis fulminante o trombosis.

42. El método de la reivindicación 13, 21, 34 o 37, en donde el trastorno hemorrágico es hemofilia A, hemofilia B, anemia hemolítica autoinmune, un enfermedad del colágeno, la enfermedad de von Willebrand (VWD), púrpura de Henoeh-Schonlein, hemorragia extendida generalizada aguda, hiperfibrinolisis primaria, esquistosomiasis hepatoesplénica, deficiencias de Factores o hemostasis.