Dispositivo intracelular para el estudio de parámetros intracelulares en células,

órganos y tejidos.

Esta invención se refiere al diseño y fabricación de un micronano dispositivo sensor de reducido tamaño (en el rango del micrómetro, 10-6 metros al nanómetro, 10-9 metros), el cual es introducible mediante procedimiento conocido, en células aisladas o en tejidos vivos para permitir el estudio y actuación externa en los procesos biológicos, bioquímicos y biofísicos que tienen lugar en su interior. La utilización de esta nueva técnica no implica de antemano y sin otra alternativa, la destrucción, o, cuanto menos, la alteración de la célula. Las técnicas de fabricación empleadas se han tomado de la microelectrónica actual

Dispositivo intracelular para el estudio de parámetros intracelulares en células, órganos y tejidos.

Esta invención se refiere a un dispositivo intracelular caracterizado por estar fabricado de modo controlado para ser introducido, o inyectado, dentro de células, órganos y tejidos vivos, y con el cual realizar trabajos en el área de la Biología o de la investigación bio-físico-química, y que comprende una lógica interna operativa.

Sector de la técnica

Esta patente de invención constituye una aplicación de las técnicas de fabricación de dispositivos micronanoelectrónicos en la ingeniería biomédica. El campo de empleo de esta patente, en general, está en todas aquellas actividades, o proyectos, que emplean, o se sirven para sus tareas, de seres vivos, como plantas, animales o microorganismos, también, puede utilizarse en el sector de la bio-físico-química farmacéutica. Otro importante sector de aplicación reside en el diagnostico clínico de patologías.

Estado de la técnica

Existen actualmente, técnicas en Biología que permiten el estudio de células o tejidos tanto de forma intro como extracelular, como pueden ser el llamado Patch Clamp, electroforesis capilar, citometria de flujo, matrices de electrodos y fluorescencia, por citar algunos. Sin embargo, todas estas técnicas tienen sus limitaciones a la hora de registrar la información, como igualmente, al analizar los procesos que tienen lugar en el medio intracelular. Recientemente, el rápido desarrollo de las técnicas de micro y nanofabricación ha permitido la obtención de sistemas microelectromecánicos (se nombran por su acrónimo inglés, MEMS, o MicroElectroMechanical Systems) enfocados al estudio y análisis más específico de células vivas. Estos sistemas han introducido nuevos conceptos como son, el denominado "Lab on a Chip" (LOC) [1,2], el Sistemas de Microanálisis Total (µTAS) [3] o el BioMEMs [4] que ofrecen más oportunidades para el análisis de células o tejidos. Estos dispositivos incluyen estructuras que pueden contener partes móviles como voladizos y diafragmas, estructuras estáticas como canales de flujos y pozos, superficies sensibles funcionalizadas químicamente, y dispositivos eléctricos como resistores y transistores.

En la literatura reciente en este dominio del conocimiento científico, se emplea un nuevo concepto de "laboratorio en una célula" (LIC, Laboratory in a cell) [5]. Esta concepción integra el uso de la unidad biológica "célula", como un laboratorio que realiza operaciones bioquímicas con las avanzadas herramientas micronano tecnológicas, para acceder y analizar, a la postre, los procesos que tienen lugar dentro de ese laboratorio celular. Para hacer esto se han de combinar micronano herramientas y/o dispositivos con materiales o sustancias específicas que respondan o interaccionen con el laboratorio celular. Se citan como ejemplos de estos materiales o substancias, los marcadores fluorescentes, los recubrimientos selectivos de iones específicos y los polímeros fusionables y funcionalizables, ésto es, operables, de modo selectivo.

Procede ahora pues explorar caminos de experimentación que permitan estudiar el interior de la célula. Los métodos de microscopia óptica y fluorescente, empleados hasta hoy en el análisis y observación desde el exterior de la célula, constituyen una herramienta biológica ampliamente experimentada [6,7]. El interés por conocer y estudiar nuevos procesos celulares conlleva la necesidad de desarrollar nuevas técnicas que permitan al experimentador mayor precisión y resolución: a modo de ejemplo, se han de citar aquí las técnicas como la resonancia magnética o el conocido como PET (Positron Emision Tomography).

Dado que los procesos celulares se suceden de manera dinámica, la mayor parte de los métodos actuales de determinación de los parámetros celulares se realizan en células manipuladas de una forma que compromete su viabilidad de forma irreversible. La necesidad de determinar parámetros celulares en células vivas bajo condiciones fisiológicas o patológicas, ha impulsado el desarrollo de métodos basados en la introducción de sustancias fluorescentes libres o acopladas a proteínas como también el desarrollo de técnicas del tipo FRET (acrónimo inglés de Fluorescence Resonance Energy Transfer), y, FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching), etc. [8].

Paralelamente, con este objetivo, se han desarrollado otras técnicas basadas en la incorporación de agentes que doten de propiedades fluorescentes a micro/nanopartículas de diferentes tipos, como son polímeros [9], puntos cuánticos o "quantum dots" [10], dendrímeros [11], o materiales como oro, ferrita, platino, cobre etc. Ejemplos de estas técnicas se han venido utilizando desde hace unos años para la construcción de marcadores o de receptores moleculares [12]. También la combinación de partículas de dimensiones nanométricas con propiedades súper o paramagnéticas ha permitido su uso en la identificación de células u orgánulos intracelulares [13], obtención de imágenes de resonancia magnética [14], vehiculización de fármacos [15] o inducción de hipertermia [16,17]. Los primeros sistemas totalmente automáticos para ensayos de tipo inmunoquímico se basaban en la utilización de pequeñas partículas magnéticas [18]. Por otra parte, la incorporación de propiedades fluorescentes a estas micro/nanoparticulas ha ofrecido un nuevo potencial para el estudio de imágenes in-vitro o in-vivo [19]. Un ejemplo de esto son los denominados Sol gel, derivados de la sílice, que permiten establecer enlaces de tipo covalente con marcadores orgánicos, convirtiéndolos en excelentes materiales para crear nanoparticulas fluorescentes [20].

Otra línea de investigación ya firmemente establecida es la utilización de diversos tipos de micronanopartículas para alterar la célula desde su interior. Ejemplo de ello es la vehiculización de fármacos. Inicialmente se trataba de un método para proteger el fármaco frente a la acción del metabolismo de degradación, pero con posterioridad se ha desarrollado la tecnología necesaria para dirigir esos fármacos hacia las células diana elegidas utilizando marcadores celulares apropiados que distinguen receptores o proteínas específicos en las células diana. Si bien estas construcciones aún no han llegado a formas comerciales, se está trabajando intensamente en ellas y en su aplicación en el campo de la terapia del cáncer [21,22]. En esta misma linea de investigación, se están empleando dendrímeros para generar nano transportadores multifuncionales que permitan dirigir los agentes terapéuticos a la localización exacta [23].

El desarrollo de herramientas similares para observar el comportamiento de la célula sin alterarla que puedan servir de sensores o actuadores no ha seguido una progresión paralela hasta el momento actual.

La vida media relativamente corta de la mayoría de las micronano partículas y sus moléculas conjugadas en el ambiente intracelular hace imposible el seguimiento de procesos celulares que tengan lugar durante periodos de tiempo prolongados. La alternativa de emplear proteínas fusionadas con marcadores fluorescentes dentro de las células, requiere el empleo de técnicas de transgénia o transfecciones virales, pero ello es técnicamente más complejo y presenta además problemas para su aplicación en humanos. Por tanto, es interesante desarrollar nuevos métodos que proporcionen sensores intracelulares más estables para así lograr la determinación de los parámetros de la fisiopatología celular animal y humana [24]. Ésto haría posible tener capacidad de detectar situaciones patológicas antes de que éstas se manifiesten.

Un ejemplo ilustrativo de la aplicación de estas técnicas, lo constituye la observación de las fluctuaciones de los niveles de concentración del catión Ca²⁺ citoplasmático. Existen varias alternativas electrofisiológicas y fluorimétricas para medir dichas fluctuaciones, una de ellas es la fabricación de micronanoparticulas con moléculas conjugadas que permitiría a los experimentadores o facultativos verificar un nuevo método de determinación de Ca²⁺ que, además de las ventajas de los ya existentes, aportaría estabilidad al agente sensor permitiendo la medición del parámetro celular durante largos periodos de tiempo, como se ha puesto de manifiesto en [25].

En esta misma linea de progreso, varios de los autores de esta Memoria han manifestado [26], recientemente, una concepción similar a lo hasta ahora aquí reseñado. Se trató entonces en un paso preliminar de este trabajo, de una...

1. Dispositivo intracelular para ser introducido o inyectado, dentro de células, órganos y tejidos vivos y con el cual realizar estudios biológicos o trabajos de investigación bio-físico-química in vivo, caracterizado porque comprende las siguientes partes:

a) un sustrato de silicio monocristalino con orientación cristalográfica bien determinada,

b) una forma geométrica variable, a determinar según el tipo de trabajo o estudio, a realizar,

c) unas dimensiones físicas laterales comprendidas entre los 50 nanómetros y las 5 micras, y un espesor entre 20 nanómetros y 2 micras,

d) una o varias superficies en donde, mediante la técnica de la micro nano litografía, se han trazado estructuras lógicas operativas observables desde el medio externo al celular, u orgánico, por medio de técnicas. apropiadas,

f) una o varias de sus superficies cubiertas, mediante la técnica de la micronano litografía, por materiales que presentan una reactividad superficial diferenciada.

2. Dispositivo intracelular según la reivindicación 1, caracterizado porque la superficie cubierta queda recubierta, a su vez, por una sustancia con actividad biológica que permita la funcionalidad del dispositivo fabricado, para dirigirlo a una determinada región de la célula o detectar algún compuesto químico.

3. Dispositivo intracelular según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha sustancia con actividad biológica está seleccionada entre moléculas fluorescentes, proteínas, anticuerpos y protectores de muerte célular.

4. Dispositivo intracelular según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque comprende motivos lógicos operativos complejos.

5. Dispositivo intracelular según la reivindicación 4 caracterizado porque comprende dispositivos MENS y NEMS.

6. Dispositivo intracelular según la reivindicación 1 caracterizado porque la superficie cubierta queda recubierta, a su vez, para formar motivos lógicos, por compuestos funcionalizados con diferentes receptores moleculares que actúan como sensores de la señal química y la transforman en una señal medible mediante sistemas externos no invasivos de la organización celular.

7. Uso del dispositivo intracelular definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores para realizar estudios biológicos o trabajos de investigación bio-química in vivo, que permiten la medida de parámetros físicos, químicos y biológicos dentro de la célula, órganos y tejidos vivos, o para la actuación sobre elementos de la misma y hacer posible monitorizar la medida desde el exterior.

8. Uso del dispositivo intracelular definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6 para monitorizar varios parámetros celulares simultáneamente lo que permite un mejor seguimiento de la evolución celular.

9. Uso del dispositivo intracelular definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6 para detectar señales celulares que marcan una ruta de respuesta celular definida y que quedan puestas de manifiesto de forma permanente sin necesidad de separar subcultivos celulares de forma periódica.

10. Uso de un dispositivo intracelular definido en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6 como actuador para la vehiculización de substancias o para la eliminación de la célula mediante una acción como la hipertermia o por un tóxico.