Un procedimiento para determinar si una bacteria diana está presente en una solución líquida cuando la bacteria diana está en una baja concentración tal que un análisis de espectrometría de masa no proporciona una señal indicativa de la presencia de la bacteria diana en la solución líquida,

que compren- de:

Infectar al menos alguna de cualquier bacteria diana presente en dicha solución líquida con un bacteriófago marcado con una sustancia que altera o cambia el espectro de masa del bacteriófago padre respecto del bacteriófago progenie, y producir un número de bateriófagos no marcados en dicha solución líquida; y

Realizar un espectro de masa sobre dicha solución líquida para determinar la presencia de un cambio en el espectro de masa que sea indicativo de la presencia de dicho bacteriófago no marcado e, indirectamente, de la bacteria diana

Procedimiento de detección de bajas concentraciones de una bacteria diana que utiliza fagos para infectar células bacterianas diana.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar bajas concentraciones de una bacteria diana en una mezcla líquida que utiliza bacteriófagos para infectar células bacterianas diana.

Antecedentes de la invención

Los procedimientos microbiológicos estándar se han fundamentado en ensayos basados en sustratos para probar la presencia de organismos específicos (Bordner, et al. 1978). Estas técnicas ofrecen niveles muy altos de selectividad pero están dificultadas por el requerimiento de, primero hacer crecer o cultivar cultivos puros del organismo localizado, lo que puede demorar 24 horas o más. Esta restricción de tiempo limita severamente la efectividad para proporcionar una respuesta rápida a la presencia de cepas virulentas de microorganismos.

Las técnicas de biología molecular están ganando rápidamente aceptación como alternativas valiosas de los ensayos microbiológicos estándar. En particular, se han empleado muchos procedimientos serológicos para evaluar un huésped de matrices para microorganismos localizados (Kingsbury & Falkow 1985; Wyatt et al. 1992). Estos ensayos se centran en utilizar anticuerpos para primero atrapar y después separar organismos localizados de otros constituyentes en mezclas biológicas complicadas. Una vez aislado, el organismo capturado puede concentrarse y detectarse mediante una variedad de técnicas diferentes que no requieren cultivar el analito biológico.

Un enfoque muy popular, denominado separación inmunomagnética (IMS), incluye inmovilizar anticuerpos de perlas paramagnéticas esféricas de microdimensiones adecuadas, y utilizar las perlas revestidas con el anticuerpo para atrapar microorganismos localizados de los medios líquidos. Las perlas se multiplican fácilmente bajo la influencia de un campo magnético facilitando la recuperación y concentración de organismos localizados. Además, el pequeño tamaño y forma de las perlas les permite dispersarse en forma pareja en la muestra, acelerando la velocidad de interacción entre la perla y la diana. Estas características favorables llevan a reducciones en el tiempo de ensayo y ayudan a simplificar el procedimiento analítico, por lo cual se hace más aplicable para una mayor capacidad de procesamiento y automatización de muestras.

Los procedimientos de detección descendente previamente utilizados con IMS incluyen ELISA (Cudjoe, et al. 1995), ensayo de transferencia de puntos (Skjerve et al. 1990), electroquimioluminiscencia (Yu and Bruno 1996) y citometría de flujo (Pyle et al. 1999). Aunque estos ensayos proporcionan resultados satisfactorios, son laboriosos para realizar y dar respuestas binarias (sí/no) que sean altamente susceptibles a los resultados falsos-positivos debido a la reactividad cruzada con analitos no diana. Recientemente se informó acerca de un método rápido para identificar bacterias específicas de mezclas biológicas complejas utilizando IMS combinado con desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI) tiempo de vuelo (TOF) espectrometría de masa (MS) (Madonna et al. 2001). Este enfoque permitió que se evalúe una variedad de matrices en cuanto a la presencia de una especie de Salmonella dentro de un tiempo de análisis total de 1 hora. Además, el procedimiento desarrollado requirió poco procesamiento de muestras, fue relativamente fácil de realizar, y la información obtenida sobre el peso molecular hizo posible discriminar entre las señales de las bacterias diana y las señales de los constituyentes de reacción cruzada.

MALDI-TOF-MS es una técnica probada para identificar microorganismos celulares enteros (Holland et al (1996); van Barr 2000; Madonna et al. 2000). En principio, MALDI es una técnica de obtención de la huella genética en la que se generan espectros de masa que caracterizan las distribuciones variables de señales de proteínas. Los perfiles de señales que se producen, debido a diferencias inherentes en proteomas microbianos, hacen posible discriminar entre organismos por debajo del nivel de cepa (Arnold and Reilly 1998). La técnica MALDI-TOF combinada con IMS incluye, en una realización, mezclar perlas inmunomagnéticas específicas de las bacterias diana con la mezcla líquida que puede contener las bacterias diana durante un corto período de incubación (por ejemplo, 20 minutos). Cualquier bacteria diana capturada por las perlas se lavan dos veces, se resuspenden en H₂O desionizada, y se aplican directamente a una sonda de muestra para MALDI. El complejo bacterias diana-perla después se cubre con un microvolúmen de solución de matriz y se seca a temperatura ambiente. La irradiación de la masa cristalina resultante con un láser de alta intensidad promueve la liberación e ionización de las proteínas celulares intactas que son posteriormente detectadas por un espectrómetro de masa TOF. El espectro de masa resultante después es interrogado en cuanto a los picos definitivos de masa que signifiquen la presencia de bacterias diana.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para determinar si una bacteria diana está presente en una solución líquida cuando la bacteria diana está presente en una baja concentración que está en o cerca del límite de detección para espectrometría en masa. Según lo utilizado en la presente memoria, el término "bacteria diana" se refiere a especies de bacterias. A su vez, la invención es aplicable a situaciones en las que es deseable determinar si una bacteria diana (por ejemplo, E. coli) está presente en una solución líquida cuando el número de bacterias diana por unidad de volumen de solución (es decir, la concentración de la bacteria diana) está por debajo del límite de detección para la espectrometría de masa. En algunos casos, una pluralidad de bacterias diana puede denominarse bacterias diana. El procedimiento es según lo definido en las reivindicaciones.

En una realización, el proceso comprende utilizar un procedimiento de amplificación biológica en el que los bacteriófagos para la bacteria diana se aplican a la solución líquida. (Lo bacteriófagos son virus que infectan las bacterias y en el proceso producen mucha progenie. Estructuralmente, el bacteriófago consiste en una envoltura proteica (cápside) que encapsula el ácido nucleico viral. La cápside se construye a partir de copias de repetición de la misma proteína. Los bacteriófagos son capaces de infectar células bacterianas específicas y debido a la multiplicación del material genético, las células eventualmente estallan liberando millones de copias del fago original.) Se permite que los bacteriófagos y cualquier bacteria diana presente en la solución líquida se incuben. Durante el período de incubación, los bacteriófagos se multiplicarán infectando la bacteria diana presente en la solución. Más específicamente, el bacteriófago replica numerosas copias de sí mismo en una bacteria diana infectada. Finalmente, el lisado de bacteria diana infectada y los bacteriófagos progenie o replicados son liberados en la solución líquida. La solución después se analiza para determinar si está presente un marcador biológico para el bacteriófago, lo que indica en forma indirecta, que la bacteria diana está presente en la solución líquida. Las técnicas posibles de espectrometría de masa incluyen las técnicas MALDI-MS y de ionización mediante electropulverización-MS.

Para asegurar que la detección de un marcador biológico para el bacteriófago indica que la bacteria diana está presente en la solución líquida, se aplica una concentración del bacteriófago a la solución líquida que está por debajo del límite de detección del marcador biológico para el bacteriófago en cualquier técnica de análisis que se emplee. Esto asegura que si se detecta el marcador biológico para el bacteriófago mediante la técnica de análisis, la concentración detectable del marcador biológico es atribuible a la réplica del bacteriófago mediante la bacteria diana presente en la solución líquida. En ciertas situaciones, el uso de dicha concentración de bacteriófago posee una multiplicidad de infección ("MOI") (es decir, relación de bacteriófagos infectantes y bacteria diana) que es demasiado baja para producir rápidamente una concentración suficiente de bacteriófagos o marcadores biológicos del bacteriófago para detección.

Otra realización del proceso trata este problema añadiendo una concentración muy alta...

1. Un procedimiento para determinar si una bacteria diana está presente en una solución líquida cuando la bacteria diana está en una baja concentración tal que un análisis de espectrometría de masa no proporciona una señal indicativa de la presencia de la bacteria diana en la solución líquida, que compren- de:

Infectar al menos alguna de cualquier bacteria diana presente en dicha solución líquida con un bacteriófago marcado con una sustancia que altera o cambia el espectro de masa del bacteriófago padre respecto del bacteriófago progenie, y producir un número de bateriófagos no marcados en dicha solución líquida; y

Realizar un espectro de masa sobre dicha solución líquida para determinar la presencia de un cambio en el espectro de masa que sea indicativo de la presencia de dicho bacteriófago no marcado e, indirectamente, de la bacteria diana.

2. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha etapa o infección comprende aplicar una primera cantidad de dicho bacteriófago a dicha solución líquida de manera tal que probablemente haya un alto número de multiplicidad de infección ("MOI").

3. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha etapa de realización comprende llevar a cabo un análisis MALDI.

4. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha etapa de realización comprende llevar a cabo un análisis MALDI-TOF.

5. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha etapa de realización comprende llevar a cabo un análisis de espectrometría de masa de ionización por electropulverización.

6. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende separar dicha bacteria diana de dicha solución líquida.

7. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha etapa de separación comprende utilizar perlas inmunomagnéticas revestidas con anticuerpos para dicha bacteria diana.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho bacteriófago marcado es biotinilado.

9. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 8, que además comprende: separar dicho bacteriófago biotinilado de dicha mezcla.