Un procedimiento para la detección de al menos un parásito intracelular en una muestra,

que comprende las etapas de: a) proporcionar: ES 2 348 594 T3 i) un tubo Shell-Vial que contiene un cultivo celular continuo, en el que el cultivo celular comprende una monocapa de células sobre un cubreobjetos, en el que dicho vial se ha congelado y descongelado in situ, y ii) una muestra sospechosa de contener al menos un parásito intracelular; b) añadir dicha muestra a dicho cultivo celular para producir un cultivo inoculado; c) incubar dicho cultivo inoculado en condiciones tales que dicho parásito intracelular infecte dichas células de dicho cultivo celular para producir un cultivo infectado; y d) detectar la presencia de dicho parásito intracelular dentro de las células de dicho cultivo infectado, en el que dicha detección comprende la observación de: i) efectos citopáticos que comprenden cambios en la estructura celular, ii) fluorescencia que comprende cambios en las características de emisión de compuestos cromogénicos o iii) colores que comprenden cambios en las características de absorción de luz de compuestos cromogénicos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona procedimientos y composiciones para el cultivo, congelación y ensayo in situ de células cultivadas. En particular, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la conservación a largo plazo de células en formatos de ensayo listos para usar. Además, la presente invención proporciona medios rápidos y fáciles de usar para diagnosticar infecciones víricas y de otro tipo. Además, la presente invención proporciona medios fáciles de usar para cultivar y almacenar células in situ para procedimientos de ensayo. De hecho, la presente invención hace que procedimientos de diagnóstico de virus, clamidias y otros organismos sean accesibles para laboratorios pequeños, incluyendo aquellos sin posibilidades de cultivo de células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Puesto que los parásitos intracelulares (por ejemplo, virus y Chlamydia) requieren células vivas para replicarse, el diagnóstico de una infección debida a estos organismos depende del uso de animales (por ejemplo, ratones lactantes), huevos embrionados o cultivos celulares. Como los cultivos celulares son mucho menos costosos y es más fácil trabajar con ellos que con animales o huevos embrionados, los cultivos celulares han sido durante mucho tiempo el pilar de los procedimientos de diagnóstico para parásitos intracelulares y virus en particular. De hecho, los cultivos celulares son la base sobre la que se construye un laboratorio de virología. Estos cultivos pueden producirse en el propio laboratorio a partir de tejidos u órganos animales o, más comúnmente, adquirirse de proveedores comerciales.

Independientemente de su procedencia, los cultivos celulares deben mantenerse a lo largo del tiempo para asegurar un suministro en todo momento de células para cultivo y diagnóstico de infecciones causadas por parásitos intracelulares. Por ejemplo, Smith y colaboradores (Smith y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 29, nº 3, páginas 463-465) desvelan la detección de VRS en secreciones nasofaringeas por la técnica de centrifugación y cultivo Shell-Vial. En el laboratorio, las células de mamífero se congelan de forma rutinaria para minimizar las oportunidades de contaminación de los cultivos, evitar errores de manipulación que podrían dar como resultado la pérdida del cultivo y minimizar el número de líneas celulares que deben manipularse diariamente. Las reservas de cultivos celulares congelados también son útiles para minimizar la deriva genética y el desplazamiento genético, la senescencia y los cambios fenotípicos indeseables que pueden producirse cuando se cultivan líneas celulares continuas y finitas durante periodos de tiempo prolongados.

Se han desarrollado procedimientos de congelación para minimizar el impacto del choque osmótico y la formación de cristales de hielo intracelulares, dos factores que contribuyen a la pérdida de viabilidad celular durante la congelación. Se usan comúnmente crioprotectores tales como glicerol y dimetilsulfóxido (DMSO) para ayudar a prevenir la muerte celular durante la congelación. Además del uso de crioprotectores, los procedimientos tradicionales usan un enfriamiento lento (de aproximadamente 1 ºC por minuto) hasta que las células alcanzan una temperatura de -25 ºC. Una vez que se alcanza esta temperatura, las células pueden enfriarse rápidamente hasta -70 ºC o -196 ºC (es decir, la temperatura del nitrógeno líquido) sin una pérdida adicional de viabilidad celular. La omisión del crioprotector o la congelación rápida causan la formación de cristales de hielo intracelulares que pueden romper las membranas celulares y dar como resultado muerte celular. Ralentizando el enfriamiento de las células, el medio externo se vuelve superenfriado y se forman núcleos de cristales de hielo en el líquido extracelular. Esto da como resultado un entorno extracelular que contiene un gradiente salino elevado artificialmente que, a su vez, causa un gradiente osmótico. Este gradiente provoca que el agua difunda hacia fuera de las células y que los crioprotectores no electrolíticos difundan hacia las células. Esta “deshidratación” de las células tiende a minimizar el choque osmótico y la formación de cristales de hielo intracelulares. (Véase, por ejemplo, Wiedbrauk y Johnston, “Mammalina Cell Culture Procedures, en Manual of Clinical Virology, páginas 33-44 [Raven Press, Nueva York, 1993] para una descripción de estos acontecimientos).

La fabricación y el uso de células crioconservadas se conoce a partir de la técnica anterior, véase, por ejemplo, Ohno y col., CYTOTECHNOLOGY, vol. 5, 1991, páginas 273277, documentos US-A-5 925 511 y Watts y col., HUMAN TOXICOLOGY, vol. 15, nº 1, 1996, páginas 30-37.

Sin embargo, los procedimientos de congelación usados comúnmente requieren equipamiento y entrenamiento especializado. Además, se usan típicamente productos químicos peligrosos tales como DMSO. Además, la descongelación de las células congeladas mantenidas en nitrógeno líquido representa riesgos tales como la explosión de los viales o tubos, así como el peligro de pérdida de viabilidad celular debido a una manipulación inapropiada (por ejemplo, una descongelación lenta más que rápida). Una vez que se han descongelado las células, el medio de congelación debe retirarse y las células deben aclararse y el cultivo revivirse antes de su uso para el cultivo y/o detección de parásitos intracelulares. Una vez revividos, los cultivos se ponen con frecuencia en formatos adecuados para la detección e identificación de virus, incluyendo placas multipocillo (por ejemplo, placas de microtitulación), tubos y portaobjetos. Por lo tanto, los cultivos deben transferirse desde su matraz de cultivo a estos otros formatos antes de su uso. Esto requiere un equipo adicional y tiempo de personal antes del uso de los cultivos según se desee. Se requieren cultivos celulares y procedimientos que sean fáciles de usar, que estén fácilmente disponibles, particularmente en formatos listos para usar, cuyo uso requiera escaso tiempo y/o experiencia por parte del operario y que sean fiables.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona procedimientos y composiciones para el cultivo, congelación y ensayo in situ de células cultivadas. En particular, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la conservación a largo plazo de células en formatos de ensayo listos para usar. Además, la presente invención proporciona medios rápidos y fáciles de usar para diagnosticar infecciones víricas y de otro tipo. Además, la presente invención proporciona medios fáciles de usar para cultivar y almacenar células in situ para procedimientos de ensayo. De hecho, la presente invención hace que los procedimientos de diagnóstico de virus, clamidias y otros organismos sean accesibles para laboratorios pequeños, incluyendo aquellos sin posibilidades de cultivo de células.

La presente invención proporciona procedimientos para la detección de parásitos intracelulares en una muestra de acuerdo con la reivindicación 1. En algunas realizaciones, el sustrato es un cubreobjetos de vidrio. En otras realizaciones preferidas más, el sustrato de plástico es el pocillo de una placa multipocillo. En algunas realizaciones, el parásito intracelular se selecciona del grupo que consiste en virus y bacterias.

En algunas realizaciones, la observación comprende una observación para determinar la presencia de un efecto citopático, mientras que en otras realizaciones, la observación comprende una observación para determinar la presencia de células fluorescentes. En otras realizaciones más, la observación comprende una observación para determinar la presencia de células azules. En algunas realizaciones preferidas, se realizan múltiples observaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la observación para determinar el efecto citopático se combina con la observación para determinar células fluorescentes y/o la observación para determinar células azules. Como se describe en el presente documento, en realizaciones preferidas, la observación para determinar células fluorescentes se efectúa usando anticuerpos marcados que reconocen un antígeno (por ejemplo, viral o bacteriano) presente en el cultivo (es decir, debido a la infección de las células por el virus o virus y/o bacterias). Sin embargo, no se pretende limitar la presente invención a ningún producto de fluorescencia, sustrato, enzima o color particular. De hecho, se pretende que múltiples anticuerpos y marcadores de...

1. Un procedimiento para la detección de al menos un parásito intracelular en una muestra, que comprende las etapas de:

a) proporcionar: i) un tubo Shell-Vial que contiene un cultivo celular continuo, en el que el cultivo celular comprende una monocapa de células sobre un cubreobjetos, en el que dicho vial se ha congelado y descongelado in situ,y ii) una muestra sospechosa de contener al menos un parásito intracelular;

b) añadir dicha muestra a dicho cultivo celular para producir un cultivo inoculado; c) incubar dicho cultivo inoculado en condiciones tales que dicho parásito intracelular infecte dichas células de dicho cultivo celular para producir un cultivo infectado; y d) detectar la presencia de dicho parásito intracelular dentro de las células de dicho cultivo infectado, en el que dicha detección comprende la observación de:

i) efectos citopáticos que comprenden cambios en la estructura celular, ii) fluorescencia que comprende cambios en las características de emisión de compuestos cromogénicos o iii) colores que comprenden cambios en las características de absorción de luz de compuestos cromogénicos.

2. Un procedimiento para la producción de un cultivo celular congelado listo para usar, que comprende las etapas de:

a) proporcionar: i) una línea celular continua y ii) un cubreobjetos colocado dentro de un tubo Shell-Vial;

b) poner dicha línea celular sobre dicho cubreobjetos, produciéndose una monocapa de células unidas en dicho cubreobjetos; y c) congelar dicho vial para producir un cultivo celular congelado listo para usar, en el que tras la descongelación dicho cultivo celular es capaz de infectarse con al menos un parásito intracelular.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho cubreobjetos se selecciona del grupo que consiste en vidrio y plástico.

4. El procedimiento de la reivindicación 2 ó 3, en el que dicho cubreobjetos es un

cubreobjetos de vidrio.

5. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho cubreobjetos es un cubreobjetos de vidrio que se pone en un tubo Shell-Vial antes de la congelación de dicha monocapa.

6. Un cultivo celular congelado listo para usar que comprende una monocapa celular unida a un cubreobjetos, producido de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 2.

7. Un procedimiento para la detección de al menos un parásito intracelular en una muestra, que comprende las etapas de:

a) proporcionar: i) la monocapa de células de la reivindicación 6 y ii) una muestra sospechosa de contener al menos un parásito intracelular;

b) descongelar dicha monocapa de células; c) añadir dicha muestra a dicha monocapa de células para producir un cultivo inoculado; d) incubar dicho cultivo inoculado en condiciones tales que dicho parásito intracelular infecte dichas células de dicha monocapa de células para producir un cultivo infectado; y e) detectar la presencia de dicho parásito intracelular dentro de las células de dicho cultivo infectado, comprendiendo dicha detección la observación de:

i) efectos citopáticos que comprenden cambios en la estructura celular, ii) fluorescencia que comprende cambios en las características de emisión de compuestos cromogénicos o iii) colores que comprenden cambios en las características de absorción de luz de compuestos cromogénicos.

8. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 7, en el que dicho parásito intracelular se selecciona del grupo que consiste en virus y bacterias.

9. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 7, en el que dicho efecto citopático se selecciona del grupo que consiste en destrucción celular, sincitios, redondeo de células, formación de vacuolas y cuerpos de inclusión.

10. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 7, en el que dicha fluorescencia comprende células fluorescentes.

11. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 7, en el que dicho color comprende células azules.