COMPOSICION PARA LA PERMEABILIZACION CELULAR QUE COMPRENDE NOG, HMP, CLORURO DE RUBIDIO Y/O CLORURO DE LITIO PARA DETECTAR CELULAS VIVAS EN UNA MEMBRANA.

Composición para la permeabilización de células útil para provocar la penetración de marcadores fluorógenos en una célula mientras que preserva la viabilidad de dicha célula,

caracterizada porque comprende:

- una concentración final (peso/volumen) de al menos 0,01% de N-octil-ß-D-glucopiranósido (NOG);

- una concentración final (peso/volumen) de al menos 0,1% de polifosfatos de sodio (HMP); y

- una concentración final (moles por litro) de al menos 1 mmol.l-1 de cloruro de rubidio y/o cloruro de litio

Composición para la permeabilización celular que comprende NOG, HMP, cloruro de rubidio y/o cloruro de litio para detectar células vivas en una membrana.

La presente invención se refiere a una nueva composición para la permeabilización celular que comprende la combinación de N-octil-ß-D-glucopiranósido (NOG), polifosfatos de sodio (HMP) y una sal escogida de cloruro de rubidio y cloruro de litio, la cual permite marcar a las células usando marcadores fluorógenos a la vez que se preserva la viabilidad de dichas células.

La invención también se refiere a un método para detectar y/o identificar células vivas contenidas en una muestra líquida o gaseosa sobre una membrana de filtración.

La invención se aplica más particularmente al control de calidad microbiológico de medios líquidos y gaseosos que, por ejemplo, entran en las cadenas de producción de productos alimenticios o farmacéuticos.

En este campo, los contaminantes pueden estar presentes en varias formas celulares, en particular bacterias Gram positivas o Gram negativas, diluidas en grandes volúmenes de agua o de un gas.

Sin embargo, no es suficiente detectar meramente estas células, también es necesario identificarlas precisamente y asegurar que son células vivas en estos medios y no células muertas que proceden de tratamientos a los que pueden someterse el aire o el agua antes de su uso. Por ejemplo, un tratamiento del agua con cloro u ozono puede dejar células muertas en el medio las cuales pueden detectarse visualmente sin consistir en una fuente de contaminación.

En la técnica anterior se describen numerosos métodos de detección para detectar en un período de tiempo la presencia de células vivas en un medio líquido o gaseoso sobre una membrana de filtración. En general, estos métodos comprenden:

Tal método se describe por ejemplo en la solicitud WO 01/59157. Este método ha sido objeto del desarrollo de un kit universal para la detección de células vivas conocido por el nombre de "Milliflex Rapid" (Millipore). En este método, la etapa de detección de células consiste en lisar las células filtradas e incubadas en la membranas de filtración con el fin de liberar su contenido de adenosina trifosfato (ATP). El ATP liberado se usa como marcador para identificar y cuantificar las células vivas (bioluminiscencia de ATP), el cual sirve como sustrato de una enzima (luciferasa) capaz de producir una reacción de quimioluminiscencia. Esta reacción de quimioluminiscencia da lugar a una señal de luz, la cual es capturada en forma de una imagen sintética. Esta imagen sintética permite visualizar in situ el sitio de la membrana en el que se desarrollan los microbios, de una manera similar a la enumeración realizada en una placa Petri en medio agar.

Esta técnica tiene la ventaja de detectar universalmente células que están vivas porque el ATP es una molécula que existe en abundancia en todos los organismos vivos. De este modo, permite obtener una indicación fiable del número de contaminantes presentes en la muestra ensayada.

Por otra parte, la extracción de ATP requiere lisar, y por lo tanto matar, las células, lo cual no permite cultivar subsiguientemente los microbios con el fin de caracterizarlos, es decir, determinar sus especies.

La información obtenida con respecto a la contaminación es por lo tanto de naturaleza cuantitativa y no cualitativa.

Otro método de detectar células en una membrana se describe en la solicitud de patente FR 2289984. En este método, la etapa de detectar las células retenidas en la membrana de filtración se lleva a cabo usando sondas de hibridación específicas. Las paredes de las células se hacen permeables a las sondas de detección usando una composición de permeabilización combinando polietilenoimina (PEI) y etanol, y luego, una vez que estas sondas están en el interior de las células, las sondas se hibridan específicamente con secuencias de RNA o DNA genómico presentes en el interior de las células. Estas sondas, que en general son de naturaleza polinucleótida, se seleccionan para que sean capaces de hibridarse específicamente con ácidos nucleicos para que tengan como diana una o más especies de contaminantes. Estas sondas, que están marcadas con un agente fluorescente o luminiscente, se detectan, después de una etapa de lavado, usando una cámara que permite localizar a las células en la membrana.

Aunque más específico, este método de detección no permite hacer una distinción clara entre células vivas y células muertas. Realmente, la hibridación de estas sondas puede ocurrir tanto en células vivas como en células muertas y, por lo tanto, da lugar a falsos positivos. Además, incluso aunque la composición de permeabilización permite en general mantener la integridad de la pared de las células, el método en sus varias etapas no es capaz de mantener las células vivas a causa de, en particular, una etapa de fijación de las células sobre la membrana de celulosa.

La solicitud WO 2004/050902 describe otro sistema de detección en una membrana que permite detectar la presencia de microorganismos que contaminan muestras de sangre. Este método está diseñado para evitar provocar la lisis de los microorganismos. El rasgo específico de este sistema radica en el hecho de que la detección de los microorganismos se lleva a cabo mediante la penetración de un agente de marcado en los microorganismos antes de la filtración, mientras que los microorganismos aún están en un medio líquido. A este respecto, antes de ser filtrada por la membrana y detectar las células la muestra líquida a ensayar se diluye en una disolución de permeabilización que comprende el agente de marcado y el agente de permeabilización.

Los agentes de marcado usados son moléculas de pequeño tamaño, en particular compuestos que intercalan DNA tales como derivados de cianina, yoduro de propidio, naranja de acridina o bromuro de etidio. Estos compuestos penetran con relativa facilidad a través de las paredes de los microorganismos vía la acción de agentes de permeabilización conocidos por un experto en la técnica tales como polietilenoimina (PEI), digitonina, nonensina, polimixina o cloruro de benzalconio. Los agentes intercalantes se unen al interior de los ácidos nucleicos durante la transcripción o replicación del DNA, es decir exclusivamente por las células vivas contenidas en la muestra.

Este método permite marcar universalmente células vivas a la vez que preserva la viabilidad de las células. Sin embargo, el hecho de que las células estén marcadas en un medio líquido antes de su filtración por una membrana introduce incertidumbres con respecto a la enumeración final de los resultados obtenidos. Realmente, si las células se dividen en una fase líquida mientras están siendo marcadas, el número de células detectadas en la membrana puede ser dos veces el de las células inicialmente presentes. Por otra parte, la dilución de la muestra líquida por la composición de permeabilización y de marcaje introduce un margen significativo de error en el resultado final, margen de error que se acrecienta por la probabilidad de una combinación accidental ligada a las operaciones de manipulación del fluido necesarias para llevar a cabo la detección con éxito.

Además, en esta situación, las células marcadas se filtran y detectan individualmente en la membrana, es decir célula por célula. El resultado es una señal de detección que es baja para cada una de las células. Este problema surge más particularmente cuando se usan marcadores fluorescentes. Realmente, las membranas usadas, en general fabricadas de PVDF o de celulosa, producen por sí mismas cierta fluorescencia que enmascara la débil señal de fluorescencia que procede de las células.

Durante los últimos años se han desarrollado los llamados marcadores "fluorógenos". Estos marcadores tienen el rasgo característico de emitir sólo en la región de fluorescencia cuando han sido activados de antemano por una enzima....

1. Composición para la permeabilización de células útil para provocar la penetración de marcadores fluorógenos en una célula mientras que preserva la viabilidad de dicha célula, caracterizada porque comprende:

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende cloruro de litio.

3. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende cloruro de rubidio.

4. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una mezcla de cloruro de litio y de cloruro de rubidio.

5. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la concentración final de HMP en la composición está entre 1% y 2% en peso.

6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la concentración final de NOG en la composición está entre 0,03 y 0,2% en peso.

7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque adicionalmente comprende al menos un marcador fluorógeno, el cual es una sonda de hibridación fluorógena.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el marcador fluorógeno es un compuesto seleccionado de: FDA, 6-CFDA, 5-CFDA, 5/6-CFDA, 5-maleimida FDA, dilaurato de fluoresceína, dibutirato de fluoresceína, 5(6)2',7'-dicloro-CFDA, 5(6)-sulfo-FDA, 5(6)2',7'-dicloro-FDA, éster de 5,6-CFDA-N-hidroxisuccinimida, dipropionato de fluoresceína, di-beta-D-galactosidasa fluoresceína, fosfato de 3-o-metil fluoresceína, éster penta-acetoxi de 2',7'-bis(carboxietil)-5(6)-carboxi-fluoresceína (BCECF/AM), éster penta-acetoxi de 2',7'-bis(carboxietil)-5(6)-fluoresceína (BCECF/AM), diacetato de azidofluoresceína, diacetato de clorometilfluoresceína, diacetato de eosina, diacetato de carboxieosina, acetato de 4-metilumbelliferilo, 4-metilumbelliferil ß-D-galactosidasa, 4-metilumbelliferil alfa-D-manopiranósido, nanoato de 4-metilumbelliferilo, fosfato de 4-metilumbelliferilo, metil-1-umbelliferilglucoromida, alanina-7-amino-4-metilcumarina, glicina-7-amino-4-metilcumarina, prolina-7-amino-4-metilcumarina, valina-7-amino-4-metilcumarina, glicil-L-prolina-7-amino-4-metilcumarina, 1,4-diacetoxi-2,3-dicianobenceno (ABD), hidroetidina, acetato de resorufina.

9. Composición según la reivindicación 8, caracterizada porque el compuesto fluorógeno es CFDA o FDA o uno de sus derivados.

10. Uso de una composición de permeabilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en un método para la enumeración y/o identificación de células.

11. Método para a enumeración y/o identificación de células vivas en una membrana, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque en la etapa a) las células se depositan sobre la membrana por filtración a través de dicha membrana de un medio líquido o gaseoso en el cual las células están inicialmente presentes.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque el marcador fluorógeno usado en la etapa c) es una sonda de hibridación fluorógena.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque dicho compuesto marcador fluorógeno usado en la etapa b) se selecciona de: FDA, 6-CFDA, 5-CFDA, 5-maleimida FDA, dilaurato de fluoresceína, dibutirato de fluoresceína, 5(6)2',7'-dicloro-CFDA, 5(6)-sulfo-FDA, 5(6)2',7'-dicloro-FDA, éster de 5,6-CFDA-N-hidroxisuccinimida, dipropionato de fluoresceína, di-beta-D-galactosidasa fluoresceína, fosfato de 3-o-metilfluoresceína, éster penta-acetoxi de 2',7'-bis(carboxietil)-5(6)-carboxi-fluoresceína BCECF/AM), éster penta-acetoxi de 2',7'-bis(carboxietil)-5(6)-fluoresceína (BCECF/AM), diacetato de azidofluoresceína, diacetato de clorometilfluoresceína, diacetato de eosina, diacetato de carboxieosina, 1-metilumbelliferilglucoromida, acetato de 4-metilumbelliferilo, 4-metilumbelliferil ß-D-galactosidasa, 4-metilumbelliferil alfa-D-manopiranósido, nanoato de 4-metilumbelliferilo, fosfato de 4-metilumbelliferilo, alanina-7-amino-4-metilcumarina, glicina-7-amino-4-metilcumarina, prolina-7-amino-4-metilcumarina, valina-7-amino-4-metilcumarina, glicil-L-prolina-7-amino-4-metilcumarina, 1,4-diacetoxi-2,3-dicianobenceno (ABD), hidroetidina, acetato de resorufina.

15. Método según la reivindicación 14, caracterizado porque el compuesto fluorógeno es CFDA o FDA o uno de sus derivados.

16. Kit para la detección y/o enumeración de células, caracterizado porque comprende:

17. Kit para la detección y/o enumeración de células según la reivindicación 16, caracterizado porque además comprende:

18. Kit para la detección y/o enumeración de células según la reivindicación 17, caracterizado porque dicha membrana de filtración consiste principalmente en celulosa, poli(fluoruro de vinilideno) o poliétersulfona.