Cápsidas y virus de la fiebre aftosa termoestables.

Cápsida proteica aislada o virus aislado de la fiebre aftosa,

para su uso como vacuna de termoestabilidad incrementada

Cápsidas y virus de la fiebre aftosa termoestables.

La presente invención se engloba dentro del sector de la biotecnología y específicamente dentro del campo de las vacunas frente a la fiebre aftosa.

Antecedentes de la invención

La glosopeda o fiebre aftosa (FA) afecta a vacas, cerdos, ovejas y cabras (entre otros animales), y constituye una de las enfermedades animales económicamente más importantes a escala mundial, según la Oficina Internacional de Epizootias y otros organismos internacionales. La FA es endémica en muchos países, donde la vacunación de animales de interés ganadero constituye una medida preventiva crítica. La enfermedad es producida por el virus de la fiebre aftosa (VFA), y las vacunas comerciales actuales están basadas en la utilización como inmunógeno de viriones de VFA inactivados químicamente. Sin embargo, existen una serie de problemas que comprometen la eficacia de esta vacuna. Uno de los más acuciantes es que la producción de vacuna requiere la manipulación del virus infeccioso. Un escape del virus de la planta de producción o una deficiente inactivación pueden causar la aparición y propagación de la enfermedad. Otro problema es que las partículas de VFA son notablemente sensibles al calor. Un calor moderado provoca en la vacuna la disociación de la cápsida del virus en subunidades mucho menos inmunogénicas.

Por esta última razón, las vacunas actuales contra la FA requieren una cadena de frío compleja y económicamente costosa, desde las plantas de producción a los puntos de aplicación. El clima tropical o subtropical y la situación socioeconómica en muchos países en vías de desarrollo donde la enfermedad es endémica conducen frecuentemente a fallos en la cadena de frío, con el consiguiente fracaso de la vacuna para proteger a los animales. En este sentido, se han realizado esfuerzos sustanciales para desarrollar vacunas contra la FA basadas en péptidos sintéticos (no infecciosos y termoestables), pero estas vacunas experimentales presentan importantes problemas propios. Así, existe la necesidad de encontrar otras vacunas termorresistentes para su uso en la prevención de la fiebre aftosa.

Descripción de la invención

En la presente invención se han obtenido mediante técnicas de ingeniería de proteínas, partículas de VFA que presentan una elevada termoestabilidad y que pueden ser utilizadas para producir vacunas basadas en virus inactivados con una menor dependencia del funcionamiento sin fallos de una cadena de frío desde la planta de producción a los lugares de vacunación.

Tal y como se ha comentado anteriormente, está bien establecido que el calor moderado causa la disociación de las partículas de VFA en subunidades pentaméricas (Fig.1), y que es precisamente la disociación a estos pentámeros lo que reduce la inmunogenicidad de la vacuna. Por tanto, para llevar a cabo la presente invención se ha logrado aumentar la termoestabilidad de partículas de VFA mediante la utilización de técnicas de ingeniería de proteínas para la sustitución de aminoácidos en la cápsida de VFA de modo que puedan en principio establecerse nuevas interacciones moleculares entre las subunidades pentaméricas vecinas que forman la cápsida de este virus.

La aproximación seguida para obtener los virus modificados que se concretan en esta patente ha consistido en la identificación de residuos aminoacídicos en o cerca de las interfases entre pentámeros que puedan ser reemplazados por otros sin que el virus pierda su capacidad de infección (necesaria para la producción de vacuna por los métodos actuales), pero de modo que se puedan establecer interacciones electrostáticas adicionales entre las subunidades pentaméricas.

En este sentido, mediante mutagénesis dirigida sobre un clon infeccioso de VFA se ha obtenido un VFA modificado que presenta una sustitución de un aminoácido concreto en cada una de las 60 subunidades protoméricas de la cápsida, por un aminoácido capaz de establecer potencialmente una interacción iónica con otro residuo aminoacídico en una subunidad vecina. Este variante, denominado A2065H, porque presenta la sustitución de una alanina por una histidina en la posición 65 de la proteína VP2 que corresponde con la posición 351 de la SEQ ID Nº 1 (Fig. 2), ha resultado mucho más resistente a la disociación en subunidades por acción del calor que el virus no mutado del cual deriva. Su resistencia a la disociación es superior a la del virus original tanto si se mantiene durante días a 4ºC (caso de descongelación de una vacuna, pero mantenimiento en frío) como si se mantiene cierto tiempo a 42ºC (caso de fallo temporal total de la cadena de frío). Al mismo tiempo, A2065H presenta una infectividad similar a la del virus no mutado del cual deriva, y puede amplificarse para su obtención en grandes cantidades sin que la mutación se pierda. Esto permite su utilización para la producción de vacunas por el método clásico.

El variante A2065H constituye prueba de principio de que es posible incrementar la termoestabilidad de VFA, sin perder su infectividad ni una suficiente estabilidad genética, mediante la sustitución de aminoácidos de la cápsida en modo que se puedan formar interacciones electrostáticas atractivas adicionales, o neutralizar interacciones electrostáticas repulsivas preexistentes, entre subunidades de la misma. Además, A2065H se puede directamente utilizar como virus stock (semilla) de mayor termoestabilidad para la preparación de vacunas.

Por otro lado, en la presente invención se ha producido otro variante termoestable de VFA que ha resultado de una combinación compleja de mutaciones, una introducida racionalmente mediante ingeniería de proteínas, y la otra fijada por el virus como respuesta a la mutación introducida. El resultado final ha sido un doble mutante, denominado D3069E/T2188A debido a que presenta una primera sustitución de Aspártico por Glutámico en la posición 69 de la proteína VP3 que corresponde con la posición 572 de la SEQ ID Nº1 (Fig. 2) y una segunda sustitución en la posición 188 de la VP2, que corresponde al aminoácido de la posición homóloga 474 de la secuencia de referencia SEQ ID Nº1 (Fig. 2), con una infectividad similar a la del virus no mutado y siendo suficientemente estable desde el punto de vista genético. Tal y como sucede con el variante A2065H, este variante D3069E/T2188A es más estable que el virus no mutado frente a la disociación en subunidades, tanto a 42ºC como a 4ºC. A diferencia de A2065H, D3069E/T2188A no es el resultado de la utilización exclusiva de ingeniería de proteínas, porque su fenotipo es debido a la combinación de una mutación fabricada y de una mutación adicional introducida por el virus durante su replicación, en respuesta a la mutación original.

Puesto que las mutaciones de A2065H y D3069E/T2188A no se encuentran cerca en la cápsida, entendemos que una variante que contenga las tres mutaciones A2065H/D3069E/T2188A presentará, tanto a 42ºC como a 4ºC, una termoestabilidad aún mayor que A2065H y D3069E/T2188A, y será infeccioso, y razonablemente estable genéticamente.

Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una cápsida proteica aislada o virus aislado (de aquí en adelante variante de la invención), para su uso como vacuna de termoestabilidad incrementada frente a la fiebre aftosa, caracterizado porque comprende una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos el 60%, 80, 90, 95 o 99%, con la secuencia ID Nº 1 y porque:

Adicionalmente, en la identificación de un organismo como perteneciente al conjunto de los virus de la fiebre aftosa (VFA) son aplicables los parámetros siguientes, sea aisladamente o en combinación con los anteriores. Dado que las cepas del VFA son afines en cuanto a su evolución, puede esperarse que la identidad global de los genomas al nivel de los aminoácidos, y más concretamente a nivel de la secuencia aminoacídica que se recoge en la Figura 2 (correspondiente a la SEQ ID Nº1), sea de un 60% o mayor, y más preferiblemente de un 80%...

1. Cápsida proteica aislada o virus aislado, para su uso como vacuna de termoestabilidad incrementada, caracterizado porque comprende una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos el 60% con la secuencia ID N:1 y porque:

2. Cápsida proteica aislada o virus aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 80% con la SEQ ID N:1.

3. Cápsida proteica aislada o virus aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 90% con la SEQ ID N:1.

4. Cápsida proteica aislada o virus aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 95% con la SEQ ID N:1.

5. Cápsida proteica aislada o virus aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 99% con la SEQ ID N:1.

6. Cápsida proteica aislada o virus aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica es la SEQ ID Nº1.

7. Cápsida proteica aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Virus aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Vacuna que comprende una cápsida proteica aislada o virus aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para su uso en el tratamiento o prevención de la fiebre aftosa.

10. Vacuna según la reivindicación 9, que además comprende excipientes farmacológicamente aceptables.

11. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, que además comprende un adyuvante.

12. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 9-11, donde la cápsida proteica aislada o el virus aislado de las reivindicaciones 1-6 presenta un origen recombinante.

13. Vacuna que comprende dos o más tipos, serotipos, variedades o mutantes que comprendan la secuencia aminoacídica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o sus cápsidas proteicas.

14. Composición que comprende una cápsida proteica aislada o virus aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

15. Composición según la reivindicación 14 para su uso como medicamento.

16. Composición según la reivindicación 14 para su uso en el tratamiento de la fiebre aftosa.

17. Polinucleótido de RNA o DNA aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica con una identidad con la secuencia ID Nº 2 seleccionada de cualquiera de las siguientes:

donde la secuencia aminoacídica codificada conserve la sustitución del aminoácido homólogo a la alanina (A) por una histidina (H) de la posición 351 de la SEQ ID NO:2.

18. Polinucleótido de RNA o DNA aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica con una identidad con la secuencia ID Nº 3 seleccionada de cualquiera de las siguientes:

donde la secuencia aminoacídica codificada conserve las sustituciones del aminoácido homólogo a la alanina (A) por una histidina (H) de la posición 351 de la SEQ ID NO:3 y adicionalmente las sustituciones de los aminoácidos homólogos a la Treonina (T) por una Alanina (A) de la posición 474 y del Ácido Aspártico (D) por el Ácido Glutámico (E) de la posición 572 de la SEQ ID NO: 3.

19. Vector que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 17-18.

20. Vector según la reivindicación anterior, donde el vector es un plásmido.

21. Polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-18.