BIOMATERIAL CAPAZ DE EFECTUAR SUCESIVAMENTE UNA TRANSICION SOLUCION/GEL SEGUIDA DE UNA TRANSICION GEL/SOLUCION.

Procedimiento de preparación de un biomaterial, que comprende:

- al menos un monómero capaz de formar polímeros, o una mezcla de dichos monómeros y sus polímeros, siendo dicho monómero una proteína escogida entre el grupo que comprende fibrina, gliadina, miosina, globulina (7S y HS), actina, mioglobina, colágeno y sus derivados, proteínas de suero, proteínas de soja y de trigo, proteínas de yema y clara de huevo y/o un sacárido capaz de formar polímeros escogido entre el grupo que comprende carragenanos, alginatos, pectinas, quitosano, celulosa, quitina, glicógeno y almidón;

- un primer tipo de enzima capaz de degradar dichos polímeros, siendo escogido dicho primer tipo de enzima que degrada dichos polímeros, en función de la naturaleza proteica o sacárida de dichos polímeros, entre el grupo que comprende enzimas de la familia de las metaloproteinasas, familia de las serinas proteasas, familia de las cisteínas y aspartato proteasas y familia ADAM, carragenasas, pectinas liasas, poligalacturonasas, pectinas esterasas, alginatos liasas y fosforilasas, y

- eventualmente, un segundo tiempo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros,

presentándose dicho biomaterial en la forma de un gel o bien en la forma de una solución que es susceptible de efectuar sucesivamente una transición solución/gel eventualmente bajo la acción de un segundo tipo de enzima y seguidamente, bajo la acción del primer tipo de enzima, una segunda transición gel/solución,

estando caracterizado dicho procedimiento porque comprende la mezcla, en un disolvente apropiado: (i) de al menos un monómero capaz de formar polímeros; (ii) de un primer tipo de enzima capaz de degradar dichos polímeros y eventualmente (iii) de un segundo tipo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros;

en cuya mezcla la concentración de monómeros capaces de formar polímeros, la concentración de enzima capaz de degradar dichos polímeros y eventualmente la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros se escogen de forma que la resolución de las ecuaciones (I), (II), (III) y (IV) siguientes:

Biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transición solución/gel seguida de una transición gel/solución.

La presente invención se refiere, dentro del campo de la gelificación, a un biomaterial capaz de efectuar sucesivamente una transición controlada de solución/gel seguida de gel/solución y un procedimiento de preparación de este biomaterial.

Los geles son utilizados debido a sus propiedades particulares en numerosos campos, particularmente el alimentario, cosmético o farmacéutico. Un gel está compuesto al menos por dos componentes de los cuales uno, muy altamente mayoritario, corresponde al disolvente líquido y el otro es un componente que se puede calificar de sólido dispersado en el disolvente. A partir de una solución o una dispersión en estado líquido, la formación del gel es el resultado de una agregación parcial de las partículas sólidas. Esta transformación se denomina la transición de solución/gel.

En la técnica anterior son bien conocidas composiciones para obtener geles "físicos". Un gel físico corresponde a un conjunto macromolecular constituido por monómeros unidos entre ellos por enlaces de baja energía (Van der Waals, enlaces de hidrógeno, polares, etc.). La estabilidad de este conjunto está asociada a una cierta gama de condiciones físico-químicas (pH, concentración de monómeros, temperatura, calidad del disolvente, fuerza iónica, etc.). Al salirse de esta gama, el gel se convierte en solución. La transición solución/gel, por tanto, es reversible para los geles físicos. Es decir, la estructura de los geles físicos es muy sensible al entorno físico-químico y un cambio muy débil de la calidad del disolvente puede destruir completamente el conjunto e inducir así una transición gel-solución. Por el contrario, la asociación polímera que conduce al gel se puede hacer mediante un cambio débil de la calidad del disolvente.

Se conocen igualmente en la técnica anterior geles calificados de "químicos". Un gel químico corresponde igualmente a una estructura macromolecular, por lo que los monómeros están asociados mediante enlaces de elevada energía (covalentes). Por tanto, la estabilidad de este conjunto es muy elevada. Además, si estos geles químicos presentan una estabilidad mejorada, el único medio de efectuar una transición gel/solución consiste en destruir los enlaces covalentes del polímero. Este es el motivo por el que la transición gel/solución de este tipo de polímeros se dice que es irreversible.

Una familia de geles químicos corresponde a los geles enzimáticamente catalizados. Este modo de gelificación se observa sobre todo en los grandes procedimientos biológicos. La coagulación sanguínea, cicatrización, la formación de la piel, la agrupación de matrices extracelulares son procedimientos biológicos en los que el paso de las proteínas solubles al estado de gel es indispensable y tienen en común una familia de enzimas: las transglutaminasas (Tgasas), las cuales son indispensables para los procedimientos de gelificación. Esta familia de proteínas es ubicua y se encuentra tanto en las procariotas como en las eucariotas. Así, existen Tgasas diferentes en el hombre. Estas enzimas tienen la propiedad de incorporar grupos aminos en las cadenas laterales glutaminilo de las proteínas. Esta actividad permite unir las proteínas de forma covalente. Las Tgasas catalizan así la polimerización de las proteínas responsables de la formación de los retículos gelificados biológicos. Las Tgasas permiten obtener geles a partir de numerosas proteínas en la industria alimentaria y, particularmente, para la fabricación de sumiri o el endurecimiento de numerosos derivados cárnicos (jamón, alimentos reconstituidos, etc). Se pueden citar como ejemplos proteínas polimerizables, gelatina, fibrina, gliadina, miosina, globulina (7S y 11S), actina, mioglobina, proteínas de suero, particularmente caseínas y lactoglobulina, proteínas de soja, de trigo y particularmente glutenina, la yema y la clara del huevo y particularmente la ovalbúmina.

Uno de los geles proteicos más utilizados es el gel de gelatina. La gelatina se obtiene a partir del colágeno que es una proteína de estructura ubicua. El colágeno se puede encontrar en estado soluble en forma de monómeros o trímeros asociados en hélices triples. Estas hélices triples se pueden asociar en fibrillas que se pueden asociar en fibras. La triple hélice de colágeno es estable a la temperatura corporal. La gelatina se obtiene mediante la desnaturalización del colágeno. Los tejidos que contienen colágeno se someten así a un tratamiento ácido o alcalino, que conduce a la desnaturalización de la triple hélice del colágeno. Se pierde así totalmente la posibilidad de hacer fibras. Un tratamiento ácido conduciría a la formación de gelatina de tipo A y un tratamiento alcalino a una gelatina de tipo B. Por tanto, la solución de gelatina esta compuesta de cadenas aisladas de colágeno (monómeros de colágenos). Al ser múltiples las utilizaciones de la gelatina, a veces es necesario crear geles de gelatina en condiciones en las que no existan geles físicos (temperaturas elevadas, pH extremo o fuerza iónica particular). Para formar un retículo necesario en el gel, las cadenas de gelatina son entonces unidas por puentes de enlaces covalentes de enlaces covalentes y, particularmente, mediante la acción de Tgasas. Los geles así obtenidos son geles químicos.

En la actualidad numerosos campos necesitan la utilización de geles químicos debido a su estabilidad mejorada. Sin embrago, su "irreversibilidad" limitas sus utilizaciones potenciales en los campos cosméticos, alimentarios o incluso farmacéuticos. Por tanto, un mayor control de las propiedades mecánicas de los diferentes geles químicos constituye un aspecto esencial para aumentar su potencialidad.

El análisis de organismos vivos ha puesto de manifiesto la existencia de sistemas extremadamente dinámicos. En tejidos vivos, las células están en interacción con una estructura denominada matriz extracelular (MEC) que tiene un elevado contenido de proteínas. Esta estructura está ubicada principalmente en las células epiteliales y alrededor de los tejidos conectivos. Las células pueden sintetizar diferentes componentes de la matriz extracelular como el colágeno que interviene en la elasticidad o la fibronectina que interviene en los mecanismos de la adherencia. Paralelamente, la célula produce igualmente proteasas que intervienen en la degradación de la matriz extracelular. Por tanto, la célula interviene simultáneamente en la construcción y la degradación de la matriz extracelular. Por tanto, la estructura de la matriz extracelular no es una estructura irreversible y estática sino que corresponde a un equilibrio dinámico que resulta del balance entre las actividades de construcción y degradación de las proteínas sintetizadas por la célula.

De la misma forma los coágulos formados en respuesta al mecanismo de coagulación constituyen igualmente sistemas dinámicos. Por tanto, mediante la síntesis de una cascada de factores enzimáticos, se ayuda a la formación de un coágulo insoluble que resulta de la formación de un retículo de proteínas solubles. Este coágulo será seguidamente eliminado en el transcurso de la reacción de cicatrización.

En estos equilibrios dinámicos, los retículos de proteínas se asocian para hacerse insolubles y formar geles, que pueden ser asimilados a transiciones solución/gel. Al mismo tiempo, los retículos proteicos son igualmente destruidos por la acción de proteasas, pudiendo ser asimilado en esta ocasión este tipo de transición a las transiciones gel/solución. Se ayuda así a veces a transiciones sucesivas como en la coagulación en la que el coágulo se forma en primer lugar, seguidamente se degrada para dar lugar a otras reacciones según mecanismos que no son bien comprendidos.

La transición solución/gel en estos procedimientos biológicos está asociada lo más a menudo a la familia de transglutaminasas anteriormente descrita. La transición opuesta, ha saber, gel/solución, esta asociada por su parte a la actividad antagonistas de enzimas de tipo proteolítico.

Una de las familias más estudiadas es el de las metaloproteinasas de matriz (MMP). Forma una familia de endopeptidasas dependientes del zinc, que degradan la mayor parte de las proteínas de la matriz extracelular. Sin embrago, existe un gran número de familias de proteasas diferentes. Se pueden citar, como ejemplos de familias de proteasas, las serinas, proteasas como tripsina, matriptasa, cisteínas y aspartato proteasas como catepsinas B y L y catepsinas D y C, de la familia ADAM.

 

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Reivindicaciones:

1. Procedimiento de preparación de un biomaterial, que comprende:

- al menos un monómero capaz de formar polímeros, o una mezcla de dichos monómeros y sus polímeros, siendo dicho monómero una proteína escogida entre el grupo que comprende fibrina, gliadina, miosina, globulina (7S y HS), actina, mioglobina, colágeno y sus derivados, proteínas de suero, proteínas de soja y de trigo, proteínas de yema y clara de huevo y/o un sacárido capaz de formar polímeros escogido entre el grupo que comprende carragenanos, alginatos, pectinas, quitosano, celulosa, quitina, glicógeno y almidón;

- un primer tipo de enzima capaz de degradar dichos polímeros, siendo escogido dicho primer tipo de enzima que degrada dichos polímeros, en función de la naturaleza proteica o sacárida de dichos polímeros, entre el grupo que comprende enzimas de la familia de las metaloproteinasas, familia de las serinas proteasas, familia de las cisteínas y aspartato proteasas y familia ADAM, carragenasas, pectinas liasas, poligalacturonasas, pectinas esterasas, alginatos liasas y fosforilasas, y

- eventualmente, un segundo tiempo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros,

presentándose dicho biomaterial en la forma de un gel o bien en la forma de una solución que es susceptible de efectuar sucesivamente una transición solución/gel eventualmente bajo la acción de un segundo tipo de enzima y seguidamente, bajo la acción del primer tipo de enzima, una segunda transición gel/solución,

estando caracterizado dicho procedimiento porque comprende la mezcla, en un disolvente apropiado: (i) de al menos un monómero capaz de formar polímeros; (ii) de un primer tipo de enzima capaz de degradar dichos polímeros y eventualmente (iii) de un segundo tipo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros;

en cuya mezcla la concentración de monómeros capaces de formar polímeros, la concentración de enzima capaz de degradar dichos polímeros y eventualmente la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre dichos monómeros se escogen de forma que la resolución de las ecuaciones (I), (II), (III) y (IV) siguientes:

ecuaciones que describen respectivamente la evolución del número de monómeros enlazados (dg) (I), la evolución del número de monómeros en solución (ds) (II) y la evolución del número de monómeros degradados (ds) en función del tiempo (dt) (III), y la ecuación de conservación de la masa (IV), en las cuales:

- g corresponde a la cantidad de monómeros en forma enlazada,

- t corresponde al tiempo,

- V_P corresponde a la velocidad de la enzima capaz de degradar los polímeros expresada en cantidad de monómeros enlazados llevados a su forma libre por dicha enzima y por unidad de tiempo,

- K_P representa la constante de Michaelis de la enzima capaz de degradar los polímeros,

- s representa la cantidad de monómeros en forma libre,

- V_T corresponde a la velocidad de la enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros, expresada en cantidad de monómeros en forma libre enlazados por dicha enzima y por unidad de tiempo,

- K_T representa la constante de Michaelis de la enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros,

- V_H representa la velocidad de enlace, mediante enlaces de baja energía y por unidad de tiempo, de monómeros en forma libre, en el caso de monómeros capaces de polimerizarse mediante estos enlaces,

- V'_P corresponde a la velocidad de la enzima capaz de degradar monómeros en forma libre, expresada en cantidad de monómeros degradados, los cuales ya no se pueden polimerizar, generados por dicha enzima y por unidad de tiempo,

- g_t corresponde a la cantidad de monómeros en forma enlazada en el tiempo t,

- s_t corresponde a la cantidad de monómeros en forma libre en el tiempo t,

- f_t corresponde a la cantidad de monómeros degradados que ya no son capaces de formar polímeros en el tiempo t,

- S₀ corresponde a la cantidad inicial de monómeros,

permite obtener un tiempo de gelificación y la duración de gel deseados.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente apropiado es un disolvente acuoso.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la cantidad de monómeros capaces de formar polímeros está comprendida entre 0,1 y 30% en peso con respecto al peso total del biomaterial.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la relación de la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre los monómeros respecto a la concentración de enzimas capaces de degradas los polímeros es superior o igual a 1.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre los monómeros es superior a 0,001 U/ml.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una etapa de liofilización del biomaterial en forma de gel.

7. Biomaterial, obtenido mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Biomaterial según la reivindicación 7, en el que los dos tipos de enzimas están presentes simultáneamente en forma no inactivada.

9. Biomaterial según la reivindicación 8, en el que la enzima es una metaloproteinasa.

10. Biomaterial según la reivindicación 9, en el que la enzima es una termolisina bacteriana.

11. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que dicho monómero es una proteína capaz de formar polímeros, y el segundo tipo de enzima capaz de efectuar enlaces covalentes entre monómeros de proteínas es escogido entre el grupo que comprende la familia de las lisil-oxidasas y la familia de las transglutaminasas.

12. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que la relación de la concentración del segundo tipo de enzima respecto a la concentración del primer tipo de enzima es superior o igual a 1.

13. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, que comprende además un disolvente acuoso.

14. Biomaterial según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, que se encuentra en forma de un gel liofilizado.

 

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