Un antígeno quimérico recombinante que contiene la fusión de al menos tres regiones antigénicas diferentes de Toxoplasma gondii,

en el que las tres regiones antigénicas diferentes tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1

Antígenos recombinantes quiméricos de Toxoplasma gondii.

Campo de la invención

La invención descrita en el presente documento se refiere a un campo técnico de la preparación de medios diagnósticos no aplicados directamente al cuerpo animal o humano. La invención también proporciona, compuestos, procedimientos para su preparación, procedimientos para uso y composiciones que los contienen, que son adecuados para aplicación industrial en el campo farmacéutico y diagnóstico, en particular para la detección y diagnosis de infecciones de Toxoplasma gondii, así como para el tratamiento y prevención de dichas infecciones.

Antecedentes de la invención

La diagnosis precoz es un objetivo prioritario y altamente deseable en todos los campos de medicamento, en particular debido a que permite una mejora apreciable en la vida del paciente y un ahorro concomitante en la parte de los sistemas de asistencia sanitaria o en la parte de los pacientes. En el caso particular de la invención descrita en el presente documento, diagnosis temprana es la de la infección potencial o existente de Toxoplasma gondii en mujeres embarazadas, con una referencia particular para la salud del feto, y en sujetos infectados, en particular aquellos con inmunidad alterada.

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que infecta todas las células de mamífero, incluyendo los de los sujetos humanos (McCabe y Remington, N. Engl. J. Med. 1988, 318 - 313 - 5). Morfológicamente, el parásito muestra tres formas distintas de infección: taquizoito (asexual), bradizoito (en quistes de tejido, asexual) y esporozoitos (en ooquistes reproducción sexual). La transmisión típicamente se produce mediante la ingestión de carne no bien cocinada que alberga quistes de tejido u hortalizas contaminados con ovoquistes desprendidos por los gatos. La infección humana es en general asintomática y autolimitante en los huéspedes inmunocompetentes. Por el contrario, en sujetos con inmunidad alterada (en particular los afectados por SIDA AIDS), toxoplasmosis es una infección oportunista grave, que puede dar lugar a encefalitis con muy graves resultados (Luft, B.J., Remington J.S., 1992, Clin. Infect. Dis. 15, 211 - 22). Además, el contraer la infección primaria durante el embarazo puede conducir a abortos o a enfermedad fetal grave en mamíferos.

Para una extensiva visión general del problema de toxoplasmosis el lector se remite a la bibligrafía médica específica.

La diagnosis de infección por T. gondii infección se establece mediante aislamiento del microorganismo en la sangre o fluidos corporales, identificación del parásito en los tejidos, detección de secuencias de nucleótidos específicas mediante PCR, o detección de inmunoglobulinas específicas anti-T. gondii producidas por el huésped en respuesta a la infección (Beaman et al., 1995 Principles and Practice of Infectious Diseases 4ª Ed, Churchill Livingstone Inc., New York, 2455 - 75; Remington JS et al. 1995, Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, 140 - 267).

Los desafíos principales para los médicos son la diagnosis de infecciones por T. gondii primarias en mujeres embarazadas y la diagnosis de infección congénita en sus recién nacidos/niños. En ambos casos, para implementar terapias adecuadas con tiempo y evitar posible daño al feto y nacidos/niños, es muy importante establecer si la infección parasitaria se ha contraído antes o después de la concepción en mujeres embarazadas. Además, es esencial determinar cuando se produce la transmisión vertical desde la madre o al feto. Finalmente, para el tratamiento clínico de recién nacidos/niños existe una necesidad urgente de un procedimiento sensible de diagnóstico que pueda determinar, de manera temprana en su vida, los sujetos infectados y no infectados, ambos nacidos de madres con toxoplasmosis en el embarazo.

Seroconversión durante la gestación y diagnosis de infección congénita en neonatos se realiza en general intentando detectar la presencia de diversas clases de inmunoglobulinas anti-Toxoplasma (IgG, IgM, IgA, con avidez de IgG), y comparar los perfiles inmunológicos de la madre frente a su hijo.

Sin embargo, los ensayos comerciales disponibles no proporcionan suficiente sensibilidad y especificidad para permitir la diagnosis de la infección en todos los pacientes. Por lo tanto es deseable la disponibilidad de agentes de diagnóstico específicos, sensibles e innovadores.

Los antígenos de T. gondii se han conocido y están disponibles desde hace tiempo, primero de todo como mezclas de antígenos obtenidas de diversas maneras (documento FR 2.226.468, Mérieux; SU 533376, Veterinary Research Institute; JP 54044016, Nihon Toketsu Kanso), después como aislamientos posteriores de antígenos puros (documento EP 0 082 745, Mérieux; EP 0 301 961, INSERM, Pasteur; documento WO 89/5658, Transgene) y su caracterización tanto como proteínas, como de sus genes respectivos (documento WO 89/08700, U. Leland, Dartmouth Coll.; documento US 4.877.726, Res. Inst. Palo Alto; documento WO89/12683, INSERM, Pasteur; documento EP 0 391 319, Mochida Pharm.; documento IT 1,196,817, CNR; documento EP 0 431 541, Behringwerke; documento WO 92/01067, CNRS; documento WO 92/02624, U. Flinders; documento WO 92/11366, Innogenetics, Smithkline Beecham; documento US 5.215.917, Res. Inst. Palo Alto; documento WO92/25689, FR 2702491, INSERM, Pasteur; documento WO96/02654, bioMeriéux, Transgene; documento EP 0 710 724 Akzo; EP 0 724 016, bioMeriéux; documento EP 0 751 147, Behringwerke; documento US 5.633.139, Res. Inst. Palo Alto; documento WO 97/27300, Innogenetics; documento US 5.665.542, documento US 5.686.575, Res. Inst. Palo Alto; documento WO 99/32633, Heska; JP 11225783, Yano; documento WO 99/61906, Abbott; documento WO 99/66043, Smithkline Beecham; documento JP 2000300278, Yano; documento WO 00/164243, Virsol), y finalmente, el aislamiento y caracterización de regiones antigénicas de productos del gen de Toxoplasma (documento WO 03/080839, Kenton S.r.l.)

Numerosos estudios han encontrado diversas proteínas antigénicas diferentes de T. gondii y las secuencias génicas de éstas también se han determinado.

Entre las proteínas más interesantes para propósitos tanto de diagnóstico como terapéuticos, en la forma de vacunas, los inventores deben mencionar: las proteínas de micronemas (documento WO 03/080839, Kenton S.r.l.; Beghetto et al., The Joumal of Infectious Diseases, 2005, 191: 637 - 645; Beghetto et al., Intemational Journal for Parasitology, 2003, 33:163 - 173); los antígenos de superficie SAG1 (o P30) (documento WO 89/08700, Stanford University; documento WO 89/12683 Pasteur, INSERM; documento WO 94/17813, WO 96/02654, Transgene, bioMeriéux; documento EP 0 724 016, documento WO 99/61906, documento US 5.962.654, Harning et al., Clinical and Diagnostic Laboratory lmmunology, mayo de 1996, 355 - 357) y SAG2 (o P22) (Parmley et al., 1992, J. Clin. Microbiol. 30, 1127 - 33); las proteínas de gránulos densos GRA1 (o P24) (documento EP 0 301 961, Pasteur, INSERM; documento WO 89/05658, Transgene, Cesbron-Delauw, et al., 1989 P.N.A.S. USA 86, 7537 - 41), GRA2 (o P28) (documento WO 93/25689, INSERM, Pasteur; documento US 5.633.139, documento US 5.665.542, documento US 5.686.575, Res. Inst. Palo Alto; Prince et al., Mol. Biochem. Parasitol., 34 3 - 14), GRA4 (Mevelec et al., Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227 - 38), GRA6 (o P32) (documento FR 2.702.491, INSERM, Pasteur; Lecordier et al., Mol. Biochem. Parasitol. 70, 85 - 94), GRA7 (documento WO 99/61906, Abbott; Jacobs et al., Mol. Biochem. Parasitol. 91, 237 - 49) y GRA3 (Robben et al. 2002, J. Biol. Chem. 277, 17544-47): los antígenos rhoptry ROP1 (o P66) (documento US 5.976.553, U. Leland; documento EP 0 431 541, Innogenetics) y ROP2 (o P54) (Sharma et al., J. Immunol., 131, 377 - 83).

Como se describe en las referencias anteriormente mencionadas, se obtuvieron los antígenos con técnicas de ADNc recombinante en vectores de expresión. Por ejemplo, para el antígeno SAG1, documento WO 98/08700 usa vectores de expresión conocidos en fago lambda-gt11.El documento WO98/12683 usa el mismo fago y se transfecta E. coli con un plásmido propietario, o mediante la preparación de un módulo de expresión especial, como en el documento WO 96/02654. El documento EP 0 724 016 obtiene mimotopos que usan genotecas de expresión de combinación de péptidos. El documento EP 0 301...

1. Un antígeno quimérico recombinante que contiene la fusión de al menos tres regiones antigénicas diferentes de Toxoplasma gondii, en el que las tres regiones antigénicas diferentes tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12.

2. El antígeno quimérico of reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

3. El antígeno quimérico de acuerdo con reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

4. El antígeno quimérico de acuerdo con reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

5. Una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno quimérico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.

6. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende al menos tres secuencias diferentes de nucleótidos seleccionadas entre el grupo constituido por: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11.

7. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27.

8. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29.

9. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31.

10. Una secuencia de nucleótidos que se hibrida con cualquier secuencia de acuerdo con las reivindicaciones 5 a 9 en condiciones de hibridación rigurosas.

11. El antígeno quimérico recombinante codificado por la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 10.

12. La secuencia de nucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones de 5 y 10, que es una secuencia de ADN.

13. Un vector que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 12.

14. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 13.

15. Un procedimiento para la producción del antígeno quimérico de acuerdo con cualquier reivindicación de 1 y 4 u 11, que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 14 y aislamiento del producto deseado.

16. Uso de antígenos quiméricos de acuerdo con cualquier reivindicación de 1 y 4 u 11 como agentes activos para la diagnosis in vitro de infecciones por Toxoplasma gondii.

17. Uso de acuerdo con reivindicación 16 para la diagnosis de toxoplasmosis congénita en niños.

18. Uso de acuerdo con reivindicación 16 para la diagnosis del tiempo de infección.

19. Kits para la diagnosis de infección por Toxoplasma gondii, que contiene al menos un antígeno quimérico de acuerdo con cualquier reivindicación de 1 a 4 u 11.

20. Kits para la diagnosis de una infección aguda y/o crónica por Toxoplasma gondii que contiene al menos un antígeno quimérico de acuerdo con cualquier reivindicación de 1 a 4 u 11.

21. Antígenos quiméricos de acuerdo con cualquier reivindicación de 1 a 4 u 11 para uso como medicamentos.

22. Uso de antígenos quiméricos de cualquier reivindicación de 1 a 4 u 11 como ingredientes activos para la preparación de medicamentos para la prevención o tratamiento de infecciones por Toxoplasma gondii.

23. La secuencia de nucleótidos de cualquier reivindicación de 5 a 10 para uso como medicamentos.

24. Uso de la secuencia de nucleótidos de cualquier reivindicación de 5 a 10 para la preparación de medicamentos útiles para el tratamiento o prevención de infecciones por Toxoplasma gondii.

25. Composición farmacéutica, en particular en la forma de una vacuna, que contiene al menos un antígeno quimérico para cualquier reivindicación 1 a 4 u 11.

26. Composición farmacéutica, en particular en la forma de una vacuna, que contiene al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquier reivindicación de 5 a 10.

27. Composición de acuerdo con reivindicación 25 ó 26 adecuada para uso humano y/o veterinario.