ANTAGONISTAS DE IL-21.

Una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID NO:3 o la SEQ ID NO:5

Antagonistas de IL-21.

Las interleuquinas son una familia de citoquinas que median en respuestas inmunológicas, incluyendo la inflamación. Las interleuquinas median en una diversidad de patologías inflamatorias. Para las respuestas inmunológicas son fundamentales las células T, que producen muchas citoquinas e inmunidad adaptativa frente a antígenos. Las citoquinas producidas por las células T se han clasificado como de tipo 1 y de tipo 2 (Kelso, A., Immun. Cell Biol., 76:300-317, 1998). Las citoquinas de tipo 1 incluyen IL-2, IFN-? y LT-a, y están implicadas en respuestas inflamatorias, inmunidad vírica, inmunidad parasitaria intracelular y rechazo de aloinjertos. Las citoquinas de tipo 2 incluyen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, y están implicadas en respuestas humorales, inmunidad frente a helmintos y respuestas alérgicas. Las citoquinas que son compartidas por el tipo 1 y el tipo 2 incluyen IL-3, GM-CSF y TNF-a. Existen algunas pruebas que sugieren que las poblaciones de células T productoras de citoquinas de tipo 1 y de tipo 2 migran preferentemente hacia diferentes tipos de tejido inflamado.

Las células T maduras pueden ser activadas, es decir, por un antígeno u otros estímulos, para que produzcan, por ejemplo, citoquinas, moléculas de señalización bioquímica o receptores que influyen posteriormente en el destino de la población de células T. Las células B pueden ser activadas a través de receptores sobre su superficie celular, incluyendo el receptor de células B y otras moléculas accesorias, para que realicen funciones celulares accesorias, como la producción de citoquinas.

Las actividades in vivo demostradas de la familia de las citoquinas en la inflamación y las enfermedades autoinmunológicas ilustran el enorme potencial clínico de los antagonistas de citoquinas y su necesidad. La presente invención trata de estas necesidades, proporcionando antagonistas de la citoquina IL-21, así como composiciones y métodos relacionados.

La presente invención proporciona estos polipéptidos para estos y otros usos que serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de las indicaciones que aparecen en la presente.

El documento WO 00/53761 describe moléculas polinucleotídicas y polipeptídicas de zalfa11 y sus correspondientes métodos y usos.

La presente invención proporciona una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID NO:3 o la SEQ ID NO:5. En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula polinucleotídica aislada que codifica un polipéptido antagonista de IL-21 que comprende la SEQ ID NO:4 o la SEQ ID NO:6. Estas secuencias incluyen mutaciones en la hélice D de IL-21.

En una realización, la presente invención proporciona una molécula antagonista con un truncamiento del polipéptido de IL-21 después del resto 147 (Met), y en la que el resto Gln₁₄₅ (SEQ ID NO:2) se muta hacia Asp₁₄₅ (como se muestra en SEQ ID NO:4). Estas mutaciones producen una proteína con una IC₅₀ de 10, y una EC₅₀ que es indetectable. El polipéptido resultante, que se denominó ligando zalfa11 I156ST/Q153D (ST indica truncamiento, en este caso en el resto aminoácido 156), demostró que se unía al receptor cognado con especificidad y sin señalización detectable.

En otra realización, la presente invención proporciona una molécula antagonista en la que el resto Gln₁₄₅ (mostrado en SEQ ID NO:2) se muta hacia Asp₁₄₅ (mostrado en SEQ ID NO:6), e Ile₁₄₈ (mostrado en SEQ ID NO:2) se muta hacia Asp₁₄₈ (mostrado en SEQ ID NO:6). Estas mutaciones producen una proteína con una IC₅₀ de 10, y una EC₅₀ que es indetectable. El polipéptido resultante, denominado ligando zalfa11 I156D/Q153D, demostró que se unía al receptor cognado con especificidad y sin señalización detectable.

Un aspecto de la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende al menos dos polipéptidos, en los que al menos uno de los polipéptidos comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6, y una segunda secuencia polipeptídi- ca.

Otro aspecto de la invención proporciona un vector de expresión, que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, un promotor de la transcripción, y un terminador de la transcripción, en el que el promotor está unido operablemente a la molécula de ácido nucleico, y en el que la molécula de ácido nucleico está operablemente unida al terminador de la transcripción.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una célula hospedante recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5, en la que la célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en bacterias, células de levadura, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero y células vegetales.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un polipéptido según la reivindicación 3, comprendiendo dicho método la etapa de cultivar células hospedantes recombinantes que comprenden el vector de expresión de la reivindicación 5, y que producen el polipéptido.

Descripción detallada de la invención

Antes de exponer en detalle la invención puede resultar útil para su comprensión definir los siguientes términos y expresiones:

La expresión "marcador de afinidad" se emplea en la presente para indicar un segmento polipeptídico que puede unirse a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o la detección del segundo polipéptido, o para proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína para la cual se encuentra disponible un anticuerpo u otro agente de unión específica puede utilizarse como marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad incluyen la proteína A con un tramo de polihistidina (Nilsson et al., EMBO J., 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol., 198:3, 1991), la glutatión S-transferasa (Smith y Johnson, Gene, 67:31, 1988), el marcador de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7952-7954, 1985), la sustancia P, el péptido Flag^TM (Hopp et al., Biotechnology, 6:1204-1210, 1988), el péptido de unión a estreptavidina, u otro epitopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification, 2:95-107, 1991. Los ADN que codifican marcadores de afinidad están disponibles en fuentes comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

La expresión "variante alélico" se emplea en la presente para indicar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural a través de la mutación, y puede producir polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (no se producen cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión "variante alélico" también se emplea en la presente para indicar una proteína codificada por un variante alélico de un gen.

Las expresiones "amino-terminal" y "carboxilo-terminal" se emplean en la presente para indicar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando lo permita el contexto, estas expresiones se emplean haciendo referencia a una secuencia o una porción particulares de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una secuencia concreta colocada en posición carboxilo-terminal con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido está colocada próxima al carboxilo terminal de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el carboxilo terminal del polipéptido completo.

La expresión "pareja de complemento/anticomplemento" indica restos no idénticos que forman una pareja estable, unida de forma no covalente, bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o la estreptavidina) son miembros prototípicos de una pareja de complemento/anticomplemento. Otros ejemplos de parejas de complemento/anticomplemento incluyen parejas de receptor/ligando, parejas de anticuerpo/antígeno...

1. Una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID NO:3 o la SEQ ID NO:5.

2. Una molécula polinucleotídica aislada que codifica un polipéptido antagonista de IL-21 que comprende la SEQ ID NO:4 o la SEQ ID NO:6.

3. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO:4 o la SEQ ID NO:6.

4. Una proteína de fusión que comprende al menos dos polipéptidos, en la que al menos uno de los polipéptidos comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6, y una segunda secuencia polipeptídica.

5. Un vector de expresión que comprende la molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 1, un promotor de la transcripción, y un terminador de la transcripción, en el que el promotor está unido operablemente a la molécula polinucleotídica, y en el que la molécula polinucleotídica está unida operablemente al terminador de la transcripción.

6. Una célula hospedante recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5, en la que la célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en bacterias, células de levadura, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero y células vegetales.

7. Un método para producir un polipéptido según la reivindicación 3, comprendiendo dicho método la etapa de cultivar células hospedantes recombinantes que comprenden el vector de expresión de la reivindicación 5, y que producen el polipéptido.